Биохимична диагностика на чернодробни заболявания. Кратка информация за структурата на черния дроб.

Черният дроб е неспарен орган с тегло 1300-1800 г. Повече от 60% от чернодробните клетки са паренхимни клетки - хепатоцити, 25% са клетки на ретикулохистиоцитната система (CSG), ендотелните или купферовите клетки, останалите са дуктални, съединителна тъкан и други клетки.

Структурната и функционална единица на черния дроб е чернодробният ацинус или чернодробната добив, която се формира главно от хепатоцитите (фиг. 1). В центъра на чернодробната лобула е чернодробната вена, от която се излъчват чернодробните лъчи, състоящи се главно от един ред хепатоцити. Чернодробната вена е разположена в центъра на лобулата, а по периферията има портално поле с клони на чернодробната артерия, портална вена и най-малкия жлъчен капиляр. Между лъчите са разширени капиляри - синусите на черния дроб. Хепатоцитите, които образуват греди, от едната страна, наречени васкуларен полюс, се сблъскват със синусите и инвагинациите на мембраната на съседната страна, наречена жлъчен (жлъчен) полюс, образуват първичните жлъчни капиляри (фиг. 2). Характерна особеност на жлъчните каналикули е пълното им изолиране от кръвоносните капиляри. Чрез мембраната на съдовия полюс ендоцитоза и екзоцитоза на различни молекули, и на жлъчните - освобождаването на вещества от клетката. Порталната вена и чернодробната артерия влизат в черния дроб, а чернодробната вена и жлъчните пътища излизат навън.

Acini се разделя на 3 функционални зони: в 1 зона има клетки, съседни на порталния тракт, те са по-добре снабдени с кислород и хранителни вещества. Клетките на третата зона, разположени около чернодробната вена, са по-малко снабдени с кислород и субстрати и са по-чувствителни към исхемия. Клетките на тази зона са включени в метаболизма на лекарствата и са обект на хепатотоксични лекарства.

При провеждане на лабораторни изследвания за правилна диагноза е важно да се знае разпределението на ензимите в клетката. По-долу са дадени данни за най-често използваните ензими за диагностика.

цитоплазма съдържа аланин аминотрансфераза (ALT), част от аспартат аминотрансферазата (AST), лактат дехидрогеназа (LDH), част от гамаглутамилтранспептидаза (GGT) и други ензими.

В митохондриите (MX) повечето от AST (около 70%), глутамат дехидрогеназа (GLDG), алкохолна дехидрогеназа и много други са концентрирани.

Груб ендоплазмен ретикулум съдържа холинестераза (СЕ) и т.н.

В гладката ендоплазмена ретикулум са глюкозо-6-фосфатаза, UDP-глюкуронилтрансфераза, хем-съдържащ мембрано-свързан цитохром Р-450 и други.

лизозоми съдържат киселинни хидролази (кисела фосфатаза, рибонуклеаза и др.), които се активират чрез понижаване на рН на клетките.

Микровласти с билиарна полюс съдържат мембранно-зависими ензими, като алкална фосфатаза (алкална фосфатаза), 5-нуклеотидаза, част от GGT, левцин аминопептидаза (LAP).

Познаването на архитектурата на черния дроб и разпределението на ензимите в клетката ясно показва неравномерното повишаване на активността на ензимите в различни патологични процеси. Така, с преобладаващото увреждане на централните части на лобулите (остър алкохолен хепатит, остра венозна стаза и др.), Активността на митохондриалния глутамат дехидрогеназа се увеличава - липса на кислороден и МХ увреждане, и с поражението на порталните тракт (остър вирусен хепатит, хроничен активен хепатит - CAG), увеличава се цитоплазмена трансаминазна активност.

Биохимична диагностика на заболявания

Информация за връзка
Стоки и услуги
ремонт

Клиничната биохимия, заедно с патологичната и нормална физиология, е един от трите кита на основната медицинска наука. Без познаване на основите на тази дисциплина, лекарят не се различава от ученик, който има представа за болести само въз основа на симптоми и признаци.

Междувременно клиничните и биохимичните показатели, които следят промените в клетките на ниво молекули и химични реакции, позволяват надеждно да се определят причините за патологичните състояния на тялото като цяло. От нивото на обучение на лекаря зависи доколко компетентно ще подходи към подбора на необходимите биохимични анализи за цялостно изследване на пациента и ще може да оцени тяхната диагностична информация, стойност и надеждност.

В медицината лабораторните биохимични изследвания се използват широко за:

- правилна диагноза,

- откриване на заболяването в предклинична фаза,

- оценка на ефективността на предписаното лечение,

- наблюдение на състоянието на пациента

- прогнозиране на възможните усложнения и изходи на заболяването.

Препоръчителни биохимични тестове

Разработени са стандартизирани изследователски методи за основните системи на тялото, които трябва да се извършат непременно със съответния комплекс от симптоми:

Патология на сърдечно-съдовата система.

Ангина пекторис (коагулограма, холестерол с фракции, аминотрансферази, триглицериди, липопротеинови фракции, атерогенен индекс, лактат дехидрогеназа с изоензими, креатин киназа с изоензими);

Хипертония (холестерол с фракции, холинестераза, урея, пикочна киселина, креатинин, триглицериди, атерогенен индекс, ниво на електролити К и Na);

Атеросклероза (холестерол с фракции, липопротеинови фракции, триглицериди, атерогенен индекс);

Инфаркт на миокарда (стрес протеини, креатин киназа с изоензими, аминотрансферази, урея, холинестераза, коагулограма, пикочна киселина, лактат дехидрогеназа с изоензими);

Хипотония (17ОКС, съдържание на хидрокортизон в урината).

Патология на системата на съединителната тъкан.

Ревматизъм (общ протеин с протеинови фракции, гликопротеини, седиментни тестове, стрес протеини, хексози на гликопротеини, фибриноген, сиалови киселини);

Ревматоиден артрит (протеин, който е общ с протеинови фракции, гликопротеини, сиалови киселини);

Подагра (общ протеин с протеинови фракции, креатинин, пикочна киселина, стрес протеини, гликопротеини);

Склеродермия (общ протеин с протеинови фракции, фибриноген, стрес протеини, хидроксипролин).

Патология на жлъчната и стомашно-чревната система.

Жлъчнокаменна болест (билирубин с фракции, алкална фосфатаза, Y-глутамил транспептидаза);

Атрофичен гастрит (пепсиноген, гастрин);

Хроничен панкреатит (глюкоза, глюкозен толеранс, общ протеин с протеинови фракции, амилаза с изоензими, липаза в урината и в кръвта);

Некроза на панкреаса (амилаза);

Дистрофично-дегенеративни промени в черния дроб, мастна форма (урея, глутамат дехидрогеназа, аланин аминотрансфераза, холинестераза, аспартатаминотрансфераза);

Чернодробна цироза (урея, холестерол, аспартат аминотрансфераза, креатинин, аланин аминотрансфераза, протеинови фракции, бета-липопротеини, седиментни проби);

Хроничен хепатит (същото изследване като при цироза, плюс лактат дехидрогеназа с изоензими, общ протеин, алкална фосфатаза);

Хепатитът е остър (същото изследване, както при хроничната форма, с изключение на алкалната фосфатаза и урея).

Патология на дихателната система.

Белодробен абсцес, остър бронхит, бронхиална астма (общ протеин с фракции, стрес-протеин);

Bronchiectasis (същото, плюс фибриноген);

Хронична пневмония (общ протеин с фракции, стрес протеин, лактат дехидрогеназа с изоензими);

Пневмония остра (също като хронична, плюс гликопротеини, седиментни проби, сиалови киселини)

Туберкулоза (общ протеин с фракции, стрес протеин, сиалови киселини, гликопротеин, проби от седименти).

Патология на отделителната система.

Бъбречна недостатъчност, остра и хронична (общ протеин с фракции, креатинин, протеин урина, урея, съдържанието на електролити Na, Cl, K, Ca);

Бъбречно заболяване (същото като при недостатъчност, плюс пикочна киселина и електролит Р, с изключение на Cl);

Нефротичен синдром (същият като при недостатъчност, плюс електролит Mg с изключение на Cl);

Амилоидоза на бъбреците (същата като при недостатъчност, плюс електролит Mg с изключение на Cl и Y - глутамил транспептидаза);

Хроничен пиелонефрит (обикновен протеин с фракции, стрес-протеини, алкална фосфатаза, холинестераза, уринен протеин, Y-глутамил транспептидаза);

Гломерулонефрит (общ протеин с фракции, стрес-протеини, урея, Y-глутамил транспептидаза, креатинин, лактат дехидрогеназа с изоензими, холинестераза).

Патология на ендокринната система.

Захарен диабет (глюкоза в урината и в кръвта, инсулин, ацетон, холестерол, бета-липопротеини, с вероятност от скрита форма - тест за чувствителност към глюкоза);

Диабет без захар (глюкоза, вазопресин, тест за глюкозен толеранс);

Хипопаратиреоидизъм (алкална фосфатаза, съдържание на електролити К и Р в кръвта и урината);

Хипотиреоидизъм (тироксин, трийодтиронин, триглицериди, бета-липопротеини, холестерол, урея);

Гнойни тиреоидити (тироксин, трийодтиронин, стрес протеини, общ протеин с фракции);

Автоимунен тиреоидит (тироксин, трийодтиронин, йодна абсорбция131 от щитовидната жлеза, свързан с протеин йод);

Гушата е ендемична (същото като при автоимунна форма на тиреоидит, плюс холестерол и урея в урината);

Поглъща се дифузна, токсична (тироксин, трийодтиронин, TSH, йод протеин-свързан, глюкоза, урея, холестерол).

Ако лекарят прецени, че е необходимо, в допълнение към основните допълнителни лабораторни тестове са назначени. (Следете лечението)

Декодиране на биохимичен анализ на кръвта

Какво показва биохимичен кръвен тест?

Кръвта е един от биоматериалите на тялото. Той присъства във всички органи и тъкани. Неговият състав включва вещества, които се образуват по време на работата на всички органи. Кръвен тест за биохимия определя наличието и нивото на неговите компоненти.

Сравнявайки данните от диагностиката и нормалните стойности, е възможно да се определи функционалното състояние на органите, да се определи естеството на патологиите, които се срещат в тях. При някои заболявания биохимията на кръвта е единственият начин да се потвърди обективно диагнозата.

Освен основните (глюкоза, хемоглобин, креатинин, холестерол и др.) Биохимичният анализ показва и специфични показатели (електролити, серум, ревматоиден фактор и др.), Необходими за диагностицирането на ендокринологични и генетични заболявания. Методът е приложим и в педиатрията, спортната медицина за оценка на функционалното състояние на тялото на децата, спортистите.

Какви са показанията за биохимичен анализ на кръвта?

Често биохимията се предписва на болни или амбулаторни пациенти. Извършва се кръвен тест за диагностициране или наблюдение на ефективността на лечението. Лекарят определя индивидуално списъка с показатели, чието ниво трябва да бъде определено в пациента. Това може да бъде като един индикатор (например глюкоза при захарен диабет) или няколко (например тестове за чернодробна функция - общ протеин, билирубин, протромбинов индекс, ALT, AST - при хепатит).

Показания за изследването са заболявания:

хепатобилиарна система;
бъбреците;
ендокринна система;
сърце;
мускулно-скелетната система;
кръвоносната система;
стомашно-чревния тракт.

В комбинация с методите на инструменталната диагностика, биохимията на кръвта помага за правилната диагноза при патологията на вътрешните органи.

Как да вземете кръвен тест за биохимия?

Биохимичният анализ изследва венозната кръв. Вземете биоматериала от периферните (лъчеви или радиални) вени. При ограничен достъп до предмишницата (фрактури, изгаряния и др.), От всяка друга вена се взема кръв (по ръцете, краката, краката).

Преди да премине анализа, пациентът трябва да подготви:

8 часа преди кръводаряване, човек не може да яде, пие напитки, съдържащи захар;
за 2 дни трябва да се въздържате от алкохол и мастни храни;
в навечерието на изследването се избягва физически и емоционален стрес.

Анализът се провежда преди лечението, преди диагностични и терапевтични процедури (рентгеново изследване, физиотерапия и др.).

Мястото за пункция на кожата се третира с антисептичен - 96% етилов алкохол или разтвор на водороден пероксид. Кръв в обем от 5-10 ml се събира в стерилна суха тръба, която се изпраща в изследването.

Норми за биохимичен анализ на кръвта (таблица)

Норма при възрастни

При деца под 14-годишна възраст

Общ билирубин (tbil)

до 250 µmol / l (новородени)

Директен билирубин (idbil)

Алкална фосфатаза (алп)

Липопротеини VP (hdl)

До 6 g / l (по време на бременност)

Пикочна киселина (пикочна киселина)

С-реактивен протеин (crp)

Антистрептолизин О (също)

Как да дешифрираме биохимичния анализ?

Дешифрирането на биохимичния анализ на кръвта е сравнение на получените резултати с нормите на показателите. Формулярът за анализ съдържа пълен списък на веществата, определени от биохимичната лаборатория и техните референтни стойности. Понякога е достатъчно да се установи окончателна диагноза въз основа на отклонение от нормата на един или няколко параметъра. Но по-често, за да се потвърди, че имате нужда от резултатите от допълнителни изследвания. Следващата ще бъде разгледана, което означава отклонение от нормите на основните показатели на биохимията на кръвта, за които болестите са типични.

Общ протеин

Общият протеин е колекция от протеини в кръвната плазма. Нивото му помага да се идентифицират заболявания на вътрешните органи и кръвта. Индикаторът се повишава при условия:

дехидратация на тялото (повръщане, диария, изгаряния и др.);
остри и хронични инфекции;
онкологични заболявания.

Нивото на общия протеин намалява с:

дефицит на протеин по време на гладно;
чернодробно заболяване;
остро и хронично кървене;
тиреотоксикоза.

билирубин

Билирубинът е жлъчен пигмент, който се образува поради разрушаването на червените кръвни клетки. Метаболизмът се дължи на нормалното функциониране на черния дроб. Нивото му варира при заболявания на черния дроб, жлъчните пътища, анемията. Билирубин е свободна и свързана фракция. Увеличението на първия индикатор възниква, когато:

остър вирусен, токсичен, лекарствен хепатит;
бактериално увреждане на черния дроб (лептоспироза, бруцелоза и др.);
чернодробни тумори, първична билиарна цироза;
хемолитична анемия.

Повишеното съдържание на свързания билирубин е типично за заболявания, които нарушават потока на жлъчката:

жлъчнокаменна болест;
тумор на панкреаса;
възпалителни заболявания на жлъчните пътища и др.

ензими

Ензимната активност характеризира състоянието на вътрешните органи. Повишена производителност с поражението на органични клетки. Увеличаването на нивото на аминотрансферазата ALAT, ALAT се наблюдава, когато:

остър, хроничен хепатит;
чернодробна некроза;
миокарден инфаркт;
наранявания и заболявания на скелетните мускули;
холестаза;
тежка тъканна хипоксия.

Повишените нива на лактат дехидрогеназа (LDH) са типични за:

миокарден инфаркт, бъбреци;
миокардит;
екстензивна хемолиза;
белодробна емболия;
остър хепатит.

Високи нива на креатин фосфокиназа (CPK) могат да възникнат, когато:

миокарден инфаркт;
некроза на скелетните мускули;
епилепсия;
миозит и мускулна дистрофия.

Уреята принадлежи към групата субстрати - съединение с ниско молекулно тегло, което се синтезира от черния дроб. Нивото на веществото в кръвта зависи от филтрационната способност на бъбреците и от синтетичната функция на черния дроб. Причини за увеличението:

бъбречни заболявания (гломерулонефрит, амилоидоза, пиелонефрит, лечение с нефротоксични лекарства);
сърдечно-съдова недостатъчност;
масивна загуба на кръв;
изгаряния;
нарушение на урината;
хранене на излишък от протеин.

Причини за намаляване на нивото на карбамид: t

пост и строг вегетарианство;
отравяне с отрови;
бременност;
нарушение на синтетичната функция на черния дроб.

Пикочна киселина

Пикочната киселина е крайният продукт на метаболизма на определени протеини. Основната му част се отделя от бъбреците, а останалата част - с изпражненията. Увеличаването на нивото на пикочната киселина в кръвта показва следните състояния:

бъбречна недостатъчност;
левкемия;
лимфом;
продължително гладуване;
злоупотреба с алкохол;
предозиране със салицилати и диуретици.

Колко е биохимичен кръвен тест?

Цената на биохимичните кръвни тестове зависи от броя на определените параметри. Цената на всеки от тях варира от 130-300 рубли. Най-скъпият метод на биохимични кръвни тестове е имуноелектрофореза, цената на която в някои клиники достига 1000 рубли.

Биохимия и патобиохимия на черния дроб. Биохимична диагностика на чернодробно заболяване

Биохимична диагностика на чернодробни заболявания.

БИОХИМИЧНА ДИАГНОСТИКА НА БОЛЕСТИТЕ НА ЖИВОТНИТЕ.

Кратка информация за структурата на черния дроб.

Груб ендоплазмен ретикулум съдържа холинестераза (СЕ) и т.н.

Черният дроб се нарича централна метаболитна лаборатория, тъй като ефективно превръща веществата, идващи от червата и метаболитни продукти, образувани в различни органи и тъкани в резултат на тяхната жизнена активност. Понастоящем са известни повече от 500 метаболитни функции. Накратко разгледайте основните.

1. Синтетични. Черният дроб синтезира протеини, ензими, коагулационни фактори, холестерол, фосфолипиди и др. Основното образуване на кетонни тела възниква в черния дроб.

2. Детоксикиращи за ендогенен (амоняк, билирубин и др.). и екзогенна вещества (лекарства и др.). Детоксикацията на лекарствата включва 2 фази: 1 - модификация на лекарства в окислително-редукционни реакции при използване на цитохром Р 450 и конюгиране на лекарства с водоразтворими вещества чрез добавяне на глюкуронова, сярна киселина, глутатион и др. При заболявания на черния дроб реакциите от първата фаза се намаляват или отсъстват.

3. Секретори - секреция на жлъчката. Апаратът за жлъчно секретиране включва жлъчните каналикули, микроврали, съседните с тях лизозоми и комплекса на Голджи. Механизмът на жлъчната секреция включва освобождаването на холестерол, жлъчни киселини, пигменти, фосфолипиди под формата на специфичен макромолекулен комплекс - жлъчката мицела. Основните жлъчни киселини, образувани в черния дроб, влизат в червата, където се превръщат в вторични жлъчни киселини чрез действието на чревната флора. Последните се абсорбират в червата и отново влизат в черния дроб (ентерохепатална циркулация). Черният дроб ги свързва с глицин и таурин, превръщайки ги в амфифилни съединения с висока способност за емулгиране на хидрофобни. вещества. Всички процеси, които причиняват нарушение на съотношението на компонентите в жлъчката (хормонални, възпалителни и др.), Водят до нарушаване на секрецията на жлъчката - холестаза.

4. Отделителна - екскреция с жлъчката на различни вещества, включително твърди вещества.

Черният дроб участва във всички видове метаболизъм.

1. Обмен на протеин. Черният дроб синтезира следните протеини:

албумин 100%, фибриноген

₁-глобулини 90%, фактори на кръвосъсирването

₂-глобулини 75% (включително витамин К-зависими)

Ul-глобулини 50%, псевдохолинестераза (СЕ)

Албуминът принадлежи към най-леките кръвни протеини, OMM 65-70 kD и се синтезира изключително от черния дроб. Албумините поддържат онкотично налягане, спад в съдържанието им води до оток. Ако понижаването на концентрацията на албумин не е свързано с недохранване, нарушение на чревната абсорбция или голяма загуба на протеин, то се дължи на ясно изразено намаление на чернодробната функция. Албумините играят важна роля в транспорта на вещества, които са слабо разтворими във вода (хидрофобни). Такива вещества включват билирубин, холестерол, мастни киселини, редица хормони и лекарства. Нарушаването на транспортната функция на албумина води до много патологични промени.

Черният дроб поддържа нивото на аминокиселини, вкл. цикличен (тирозин, триптофан, фенилаланин), неутрализира амоняка, превръщайки го в карбамид. Синтезата на урея е една от най-стабилните функции на черния дроб.

2. Липиден обмен. Синтезът на холестерола е 90% от черния дроб и червата. Значителна част от холестерола в черния дроб се превръща в жлъчни киселини, стероидни хормони, витамин D₂. Черният дроб преобразува късоверижните мастни киселини, които са токсични за мозъка (4-8 въглеродни атома - капронова, изовалеринова киселина и т.н.) в дълговерижни мастни киселини (16-18 въглеродни атома).

3. Обмяна на въглехидрати. Черният дроб поддържа стабилно ниво на гликемия чрез гликогенеза, гликогенолиза, глюконеогенеза. Черният дроб произвежда инсулинази - ензими, които разграждат инсулин, поддържа нивото на млечна и пировинова киселина.

4. Пигментният метаболизъм включва превръщането в хепатоцитите чрез конюгиране с глюкуронова киселина на токсичен, мастноразтворим индиректен билирубин до нетоксичен, водоразтворим директно. Освобождаването на билирубин глюкуронид може да настъпи или чрез директна секреция в жлъчния капиляр, или чрез включване в жлъчната мицела.

5. Метаболизмът на порфирина включва синтез на хем, състоящ се от комплекс протопорфирин с желязо. Хемът е необходим за синтеза на хем съдържащи чернодробни ензими (цитохроми и др.). Вродена аномалия на синтеза на хем в черния дроб води до заболявания - чернодробна порфирия.

6. Обмяна на хормони. При заболявания на черния дроб се наблюдава повишаване нивото на хормоните, свързано с нарушаване на секрецията им с жлъчка или нарушаване на нормалния хормонен метаболизъм (недостатъчно унищожаване). Повишават се нивото на адреналин и норадреналин (медиатори на симпатиковата нервна система), минералокортикоид алдостерон, половите хормони, особено естрогените, тъканните хормони серотонин и хистамин.

7. Обмяна на микроелементи. Черният дроб синтезира протеини за транспортиране (трансферин) и отлагане (феритин) на желязо, също е основното депо на желязото. Черният дроб играе важна роля в метаболизма на медта: синтезира церулоплазмин, гликопротеин, който свързва до 90% от медта в кръвта, и също така абсорбира мед, който е свободно свързан с албумин от кръвната плазма и секретира излишната мед чрез лизозоми с жлъчка в червата. Черният дроб участва в обмена на други микроелементи и електролити.

Основните синдроми при заболявания на черния дроб.
При различни заболявания на черния дроб се нарушават определени видове метаболизъм или определени функции на органа. Някои заболявания са придружени от преобладаващо увреждане на чернодробните клетки. други - основно нарушение на изтичането на жлъчката и т.н., така че диагнозата на чернодробните заболявания често се извършва синдромно. По-долу са описани основните синдроми (Таблица 7).

1. Цитолитичен синдром (цитолиза) възниква в резултат на нарушаване структурата на чернодробните клетки, повишаване на пропускливостта на мембраната, като правило, поради повишени процеси на липидна пероксидация (LPO) и освобождаване на ензими в кръвта. При цитолитичния синдром в кръвния поток влизат както цитоплазмените, така и митохондриалните компоненти на ензимите, но цитоплазмените изоензими определят основното ниво на активност. Цитолизата основно съпътства остри чернодробни заболявания и се увеличава с обостряне на хроничните. Разграничават се следните основни механизми на цитолиза:

1) токсична цитолиза (вирусна, алкохолна, лекарствена);

2) имунна цитолиза, вкл. автоимунна;

4) хипоксичен („шоков дроб” и др.);

5) туморна цитолиза;

6) цитолиза, свързана с хранителни дефицити и неадекватност на храната.

Цитолизата не е идентична с клетъчната некроза: по време на цитолизата клетката остава жива и способна на различни видове метаболизъм, включително синтез на ензими, следователно, по време на цитолиза, активността на ензимите може да се увеличи десетки или стотици пъти и да остане повишена за дълго време. Некрозата предполага клетъчна смърт, така че повишаването на ензимната активност може да бъде значително, но краткотрайно.

Основните налични маркери на цитолиза при остър хепатит са аланин (ALT) и аспарагинови (AST) трансаминази, гама-глутамил транспептидаза (GGT), лактат дехидрогеназа (LDH).

Повишени ALT и AST наблюдавано при 88-97% от пациентите в зависимост от вида на хепатита, повече от половината от тях, има значително (10-100 пъти) увеличение. Максималната активност е характерна за 2-3-та седмица от заболяването, а връщането към нормалното е на 5-6 седмица. Превишаването на нормализацията на дейността е неблагоприятен фактор. АЛАТ активност> AST, която е свързана с разпределението на AST между цитоплазмата и митохондриите. Преобладаващото увеличение на AST е свързано с увреждане на митохондриите и се наблюдава при по-тежко увреждане на черния дроб, особено алкохол. Активността на трансаминазите се увеличава умерено (2-5 пъти) при хронични чернодробни заболявания, обикновено в острата фаза, и чернодробни тумори. За цироза на черния дроб, повишаване на активността на трансаминазите, като правило, не е характерно.

Гама-глутамил транспептидаза (GGT, GGTP, -GT) се съдържа в цитоплазмата (изоформа с ниско молекулно тегло) и е свързана с мембраните на жлъчния полюс (изоформа с високо молекулно тегло). Увеличаването на неговата активност може да бъде свързано с цитолиза, холестаза, алкохолна или наркотична интоксикация, растеж на тумора, следователно увеличаването на активността на GGT не е специфично за определено заболяване, но до известна степен универсално или скрининг за чернодробни заболявания, въпреки че включва допълнителни търсения за причината на заболяването.

Лактат дехидрогеназа (LDH) нараства при много заболявания. Диагностичната стойност на общата активност е малка и се ограничава до дефиницията за изключване на туморни и хемолитични процеси, както и за диференциалната диагноза на синдрома на Гилбърт (нормален) и хронична хемолиза (увеличена). За диагностициране на чернодробно заболяване по-значима оценка на чернодробния изоензим LDH - LDH₅.

Увеличаването на активността на един или всички ензими показва остро заболяване на черния дроб, обостряне на хронично заболяване или туморен процес, но не посочва естеството на заболяването и не позволява поставяне на диагноза.
2. Холестатичен синдром (холестаза) се характеризира с нарушение на жлъчната секреция. Някои автори идентифицират рядка аницерна форма на холестаза, свързана с промени в нормалните съотношения на компонентите на жлъчката (хормонални промени, нарушения на ентерохепаталната циркулация на холестерола). Различават се интрахепатална холестаза, свързана с нарушена секреция на жлъчката от хепатоцити или жлъчно образуване в жлъчните пътища и екстрахепатален холестаза поради обструкция на жлъчните пътища с камък, тумор или приложение на лекарства, които причиняват холестаза. При холестаза веществата, които се екскретират в жлъчката при здрави хора, влизат и се натрупват в кръвната плазма, а активността на така наречените индикаторни холестазни ензими се увеличава. Типичната иктерична форма на холестазата се характеризира със сърбеж и жълтеница.

Холестазата увеличава съдържанието на жлъчни киселини; билирубин с преобладаващо увеличение на конюгираната част на жлъчката (холебилирубин); холестерол и lip-липопротеини; ензимна активност алкална фосфатаза, GGT, 5-нуклеотидаза.

Алкална фосфатаза (алкална фосфатаза) проявява активността си при рН 9-10, се съдържа в черния дроб, червата, костната тъкан, но основният екскреторен орган е черният дроб. При хепатоцитите алкалната фосфатаза се свързва с мембраните на жлъчния полюс и епителните микроворсиви на жлъчните пътища. Причините за хиперферментацията са забавеното елиминиране на ензима в жлъчката и индуцирането на ензимен синтез в зависимост от блока на ентерохепаталната циркулация. Повишената активност при чернодробни заболявания най-често показва холестаза, при която ензимната активност се увеличава с 4-10 дни до 3 и повече пъти, както и от чернодробни тумори. С повишаване на активността на алкалната фосфатаза трябва да има диференциална диагноза с костни заболявания.

5-нуклеотидаза принадлежи към групата на алкалните фосфатази, варира успоредно с тях, но повишаването на активността му се свързва изключително с холестаза. Липсата на налични търговски комплекти обаче не позволява пълното използване на този показател.

GGT Той е и мембранно-свързан ензим, а при холестаза се повишава поради активирането на синтеза. Изследването на GGT с холестаза се счита за задължително.

Разрушаването на жлъчната екскреция води до нарушена емулгиране на мазнини и намаляване на абсорбцията на мастноразтворимите вещества в червата, включително витамин К. Намаляването на количеството на витамин К в организма води до намаляване на синтеза на витамин К-зависими фактори на кръвосъсирването и намаляване на протромбиновия индекс. (PTI). При интрамускулно приложение на витамин К с холестаза ПИ на ден се увеличава с 30%.

3. Хепатодепресивен синдром включва всяка дисфункция на черния дроб, която не е придружена от енцефалопатия. Синдромът се среща при много заболявания на черния дроб, но е най-силно изразен при хронични процеси. За да се посочи синдромът, се използват стрес тестове и определяне на концентрацията или активността на различни компоненти на серум или плазма.

Стрес тестовете са чувствителни, но рядко се използват. Те включват:

а) тестове за екскреторна функция на черния дроб - бромсулфалеин, индоцианова и др.;

б) тестове за детоксикираща функция на черния дроб - антипирин, кофеин, бърза проба.

Проучванията показват, че синтетичната функция е най-малко стабилна при чернодробни заболявания, а синтезът на тези вещества, които се образуват главно в черния дроб, намалява на първо място. Налични са и информативни показатели за хепатодекреция:

1. Албумин почти напълно се синтезира от черния дроб. Намаляване на концентрацията му се наблюдава при половината от пациентите с остър и при 80-90% от пациентите с ХСН и цироза на черния дроб. Хипоалбуминемията се развива постепенно, резултатът може да бъде намаляване на онкотичното кръвно налягане и оток, както и намаляване на свързването на хидрофобни и амфифилни съединения с ендогенна и екзогенна природа (билирубин, свободни мастни киселини, лекарства и др.), Които могат да предизвикат явления на интоксикация. Информативно паралелно определяне на албумин и общ протеин. Като правило, общото съдържание на протеин остава нормално или се увеличава поради имуноглобулини (Ig) на фона на намаляване на концентрацията на албумин. Намаляването на албумина до 30 g / l или по-малко показва хроничен процес.

2. -1-антитрипсин - гликопротеин, съставляващ 80-90% от фракцията ₁-глобулин, остър фазов протеин, синтезиран в черния дроб, е чувствителен индикатор за възпаление на паренхимните клетки. Изключително диагностично значение, свързано с вроден дефицит на протеин, което води до тежки форми на увреждане на черния дроб и други органи при деца.

3. Холинестераза серума (псевдохолинестераза, бутирилхолинестераза - HE, BChE), синтезиран от черния дроб, се отнася до₂-глобулин. Една от функциите им е разделянето на мускулните релаксанти, получени от сукцинил дихолин (слушател, дитилин). Липсата на ензим или появата на атипични форми усложнява разграждането на лекарствата, което усложнява процеса на възстановяване от анестезията. За предотвратяване на постоперативни усложнения се препоръчва да се определи ензимната активност и броя на дибукаина, т.е. степента на инхибиране на ензима дибукаин. При хронични процеси, особено цироза на черния дроб, ензимната активност намалява, а степента на редукция има прогностична стойност. Друга причина за намаляване на активността е органофосфатното отравяне.

4. Фибриноген, I коагулационен фактор, остър фазов протеин, се отнася до ₂-глобулин. Нивото на фибриноген естествено намалява при тежки хронични и остри чернодробни заболявания.

5. PTI намалява поради нарушен синтез на витамин К-зависими фактори на кръвосъсирването (II, VII, IX, X). За разлика от холестазата, нивото на IPT не се нормализира при интрамускулно приложение на витамин К. IPT е маркер за тежестта на острата чернодробна дисфункция.

6. Холестерол намалява кръвта при пациенти с хроничен хепатит и цироза на черния дроб, по-често с подостра варианта на курса. При мастен черен дроб нивата на холестерола могат да се повишат.

При хронични чернодробни заболявания в стадий на компенсация повишаването на ензимната активност е нетипично. Въпреки това, умереното увеличение (1,5-3 пъти) на активността на трансаминазите с по-високо ниво на AST показва увреждане на субклетъчните структури, по-специално MX.

4. Мезенхимално-възпалителния синдром се причинява от увреждане на мезенхимата и стромата на черния дроб, като по същество е имунен отговор на антигенната стимулация на чревния произход. Този синдром придружава както остри, така и хронични чернодробни заболявания. Маркерите на синдрома са glob-глобулини, имуноглобулини, тимолов анализ, антитела към клетъчни елементи и др.

дефиниция -глобулин се отнася до задължителните тестове за черния дроб. Нарастването на glob-глобулините, които са по същество имуноглобулини, е характерно за повечето чернодробни заболявания, но е най-силно изразено при CAG и цироза на черния дроб. Напоследък е доказано, че β-глобулините могат да бъдат продуцирани от клетките на Kupffer и плазмените клетки на възпалителни чернодробни инфилтрати. При цироза на черния дроб на фона на ниска концентрация на албумин, поради нарушение на синтетичната функция на черния дроб, се наблюдава значително увеличение на α-глобулините, докато концентрацията на общия протеин може да остане нормална или повишена.

Имуноглобулини (Ig) са протеини, включени в ф-глобулиновата фракция и притежаващи свойствата на антитела. Има 5 основни класа на Ig: IgA, IgM, IgG, IgD, IgE, но първите три се използват за диагностика. При хронични чернодробни заболявания, съдържанието на всички класове Ig се увеличава, но растежът на IgM е най-силно изразен. При алкохолно увреждане на черния дроб се наблюдава повишаване на IgA.

Тест за тимол - неспецифичен, но достъпен метод на изследване, резултатът от който зависи от съдържанието на IgM, IgG и липопротеините в серума. Тестът е положителен при 70-80% от пациентите с остър вирусен хепатит през първите 5 дни от иктеричния период, при 70-80% от пациентите с ХАХ, а при 60% с цироза на черния дроб. Пробата е нормална при обструктивна жълтеница при 95% от пациентите.

Антитела към тъканни и клетъчни антигени (ядрени, гладки мускули, митохондриални) позволяват да се идентифицират автоимунни компоненти при чернодробни заболявания.

Допълнителните изследователски методи включват дефиницията на хаптоглобин, orozomukoida,₂-макроглобулин,₂-микроглобулин, хидроксипролин, уронови киселини.
Таблица 1.

Биохимична диагностика на заболявания

Биохимична диагностика Биохимична диагностика (клинична химия (биохимия), патохимия) - посоката на клиничната лабораторна диагностика, чиято цел е да следи състоянието на пациента и да диагностицира заболявания чрез идентифициране на химични компоненти в биоматериал (кръв, урина, в някои случаи изпражнения, плеврална или цереброспинална течност),

Кръвната плазма е органичен флуид, който има сложен химичен състав, включващ голямо количество неорганични йони, ензими, хормони, протеини, липиди и въглехидрати, както и разтворени газове - въглероден диоксид и кислород. Концентрацията на всички кръвни съставки в здрав човек е в определени граници, което отразява нормалното функционално състояние както на организма като цяло, така и на всяка отделна клетка. В случай на различни заболявания, има нарушение на функциите на органи и системи, което води до дисбаланс и концентрация на един или повече кръвни съставки. Химичният анализ на кръвта в процеса на диагностиката се основава на този принцип. Списъкът на патологичните състояния, при които е необходим биохимичен анализ на кръв и урина, е доста широк и включва заболявания на сърдечно-съдовата, ендокринната, дихателната, екскреторната и други системи. Болестите в резултат на недохранване също се диагностицират чрез биохимични кръвни тестове. Алиментарните недостатъци могат да бъдат открити чрез лабораторни диагностични методи.

Някои видове туморни клетки могат да отделят специфични вещества в кръвния поток. Ролята на биохимичните лаборатории в мониторинга и диагностицирането на рак е ограничена до измерване на кръвните нива на тези “туморни маркери”.

Безопасността и ефективността на лекарствената терапия зависи от измерването на концентрацията на лекарствените вещества в кръвта. И това е само един аспект от огромната роля на биохимичната диагностика в мониторинга на терапията на пациентите.

Днес по-голямата част от изследванията на кръвта и урината се извършват с помощта на съвременни високотехнологични автоматизирани диагностични системи, чиито биохимични анализатори Ви позволяват да извършвате до 1000 теста за 1 час, до 20 или повече на всяка проба. И резултатът от диагностиката на повечето тестове се получава в рамките на 12-24 часа. Повечето лаборатории извършват определен списък от тестове денонощно, тъй като при спешна диагностика резултатите от теста трябва да са готови в рамките на 1 час.

TAT (или скоростта на лабораторната диагностика) е времето от момента, в който тестът е назначен, до момента на получаване на резултата от теста или от момента, в който материалът е отнесен до момента на получаване на резултата от изпитването. ТАТ трябва да съответства на скоростта на развитие на патологичния процес, както и на възможностите за фармакологична или друга корекция.

Някои пациенти от отделенията, интензивните отделения и интензивните отделения често се нуждаят от постоянно наблюдение на определени кръвни параметри. При тези условия медицинската сестра на този отдел може да извърши определен ограничен списък от тестове, като използва необходимото оборудване, което се намира в отдела.

ГЛАВА 4 БИОХИМИЧНА ДИАГНОСТИКА НА ПАТОЛОГИЧНИТЕ ПРОЦЕСИ И НАСЛЕДОВАТЕЛНИ БОЛЕСТИ t

4.1. САРДОВОСКАЛНА ПАТОЛОГИЯ

В областта на кардиоваскуларната патология клиничната биохимия е постигнала най-голям успех в диагностицирането на миокарден инфаркт. Методи за клинична ензимология и имунохимия позволяват да се диагностицира миокарден инфаркт в първите часове на появата му, да се установи клиничното състояние на нестабилна ангина, да се направи диференциална диагноза на тежка ангина (исхемия) и смърт на миоцитите (аноксия), за да се оцени ефективността на тромболитичната терапия и реперфузионния феномен.

В съответствие с препоръките на СЗО, диагнозата миокарден инфаркт се основава на типична клинична картина на пристъп на болка в гърдите; ЕКГ промени; повишаване на кръвната активност на кардиоспецифични ензими (маркери).

В същото време, при многократен инфаркт на миокарда, кардиосклероза и предсърдно мъждене, както и в присъствието на пейсмейкър (пейсмейкър) при пациент, е много по-трудно да се диагностицира миокарден инфаркт според ЕКГ данните. Освен това повече от 25% от пациентите, при които инфаркт на миокарда е потвърден при аутопсия, не са имали промени в ЕКГ. Според проспективно проучване, проведено в САЩ, диагнозата миокарден инфаркт без проучване на кардиоспецифични маркери на смърт на миоцити може да се направи само в 25% от случаите.

Сред пациентите, доставени на интензивното отделение със сърдечна болка, само 10-15% имат миокарден инфаркт. Необходимостта от диагностициране на миокарден инфаркт в ранните стадии се диктува от факта, че тромболитичната терапия в първите 2-6 часа намалява ранната смъртност средно с 30%, а терапията започва в 7-12 часа - само с 13%. Тромболитичната терапия след 13-24 часа не намалява смъртността.

Ранната диагностика на инфаркта на миокарда ви позволява да прилагате и трансуминална ангиопластика, а ефективността на консервативното лечение е по-висока, ако се започне възможно най-скоро.

Необходимо е също така да се проведе диференциална диагноза на миокарден инфаркт с нестабилна стенокардия, когато ранното лечение може да предотврати инфаркт на миокарда.

През последните години арсеналът от биохимични маркери за смърт на миоцитите е допълнен с нови високоспецифични тестове, които ви позволяват да диагностицирате миокарден инфаркт в първите часове на неговото появяване. Това са тестове, които могат да бъдат приложени на първия етап на медицинското обслужване, както и определянето на кардиоспецифични изоензими и протеинови маркери за смъртта на миоцитите, използвани в интензивното отделение на лечебните заведения. В същото време успехът на промишлените технологии и освобождаването на диагностични системи, основани на принципа на "сухата химия", позволяват да се определят специфични маркери на смъртта на миоцитите в първия етап на медицинското обслужване. Въпреки това, дори и при тези условия, са възможни диагностични грешки, ако патофизиологията на миокардния инфаркт и механизмите за приемане в кръвта на специфични за органа и неспецифични белтъчни маркери на миоцитна смърт не са ясно разбрани.

Локализацията в клетката има значително влияние върху скоростта на освобождаване на маркера от увредения миоцит. Цитозолните ензими се освобождават по-бързо от тези, структурирани върху вътреклетъчни мембрани. За разлика от цитозолните маркери, освобождаването на вътреклетъчния контрактилен апарат е необходимо, за да се достигне интерстициалното пространство на свързаните със структурата протеини, което забавя процеса на появата на маркери в кръвта; последните са освободени митохондриални ензими.

При изследването на сърдечните маркери на миокарден инфаркт е необходимо да се вземат предвид редица разпоредби, наричани принципи на диагностициране на миокарден инфаркт. Те включват: 1) времеви интервали; 2) изследване на маркерите за увреждане на миокарда в динамиката; 3) органо-специфичност на лабораторната диагностика на миокарден инфаркт; 4) сложният характер на диагнозата; 5) концепцията за "сива зона".

Практически значими маркери на смъртта на миоцити са каталитичната концентрация в кръвта на KK, LDH, AST, гликоген фосфорилаза (GF), увеличаване на кръвното съдържание на миоглобин, миозинови вериги, троонини Т. I. кръвните концентрации на изоензимите KK-MB и LDH₁, имунохимично определяне на СК-МВ и GF-ВВ, както и съотношението на изоформите на СК-МВ изоензима и тропонините.

При диагностицирането на миокарден инфаркт е важно да се има предвид времето, изминало от началото на ангината. Това се дължи на факта, че от момента на смъртта на миоцитите до появата на маркери в кръвта преминава доста дълъг период. Изтичането от клетките на големи протеинови молекули (CC и LDH) може да се случи само ако целостта на плазмената мембрана на миоцитите е нарушена в резултат на тяхната смърт по време на аноксия. По-малките молекули на протеиновите маркери (миоглобин, тропонин) могат да изтекат в малко количество от клетките и при условия на продължителна хипоксия с изразени промени в мембраната на миоцитите, преди разрушаването на клетките. През първите 4 часа след оклузия на коронарната артерия в зоната на максимална исхемия, около 60% от миоцитите некротизират; некрозата на останалите 40% възниква в рамките на следващите 20 часа.

Излизайки извън мембраната на миоцитите, протеиновите молекули влизат в извънклетъчната течност и текат от сърцето само през лимфните канали. Това определя доста дълъг период от време (3-6 часа) от момента на смъртта на миоцитите до появата на кардиоспецифични маркери в кръвта. На първо място, съдържанието на миоглобин, GF-BB и тропонин се увеличава в кръвта, след това - KK и кардиоспецифичния изоензим KK-MB, AST; значително по-късно повишава активността на LDH и сърдечно-специфичния изоензим LDH₁ (Фиг. 4.1). Клиничната чувствителност на кардиоспецифичните маркери до голяма степен зависи от времето, което е изтекло от смъртта на миоцитите. Така че, за KK-MB, при откриване на кръв в първите 3-4 часа след пристъп на ангина, клиничната чувствителност (диагностична точност) е само 25-45% и се увеличава до 98% в диапазона от 8-32 часа.

Фиг. 4.1. Динамика на ензимната активност при миокарден инфаркт. 1 - MW-2 / MW-1; 2 - ММ-3 / ММ-1; 3 - KK-MB; 4 - общо KK; 5 - LDH₁/ LDG₂

CK дава фалшиво отрицателни резултати в 32% от случаите, AST - в 49%, миоглобин - в 15%. Активността на LDH е надежден маркер за смърт на миоцитите след 12 часа от началото на ангина, но остава повишена за 10-12 дни. Данните за активността на кардиоспецифични маркери по отношение на по-малко от 4-6 часа след пристъп на ангина пекторис могат да доведат до диагностични грешки, когато дори с обширни инфарктни миокардни маркери на миоцитна смърт не са толкова информативни. В допълнение, скоростта на увеличаване на съдържанието на сърдечните маркери в кръвта до голяма степен зависи от продължителността на исхемията и времето на реканализация на тромбираната коронарна артерия и миокардната реперфузия след сърдечен удар.

Втората особеност на освобождаването на маркерите на смъртта на кардиомиоцитите в кръвта е характерната динамика на увеличаване и намаляване на тяхната концентрация (каталитична концентрация). Това се определя от постоянното свиване на миокарда, което води първо до бързото елиминиране на протеините от некротизираната област на миокарда и след това до пълно извличане на маркерни протеини в кръвния поток. Само при миокарден инфаркт, съдържанието на маркери за смърт на кардиомиоцитите в кръвта се увеличава в интервала от 8-24 часа.В случай на неусложнен миокарден инфаркт, има подобно маркирано елиминиране на маркерни протеини от съдовото легло. В същото време, съдържанието на всеки от маркерите „изписва” една дъгова динамична крива с различни времеви параметри. За повечето маркери, площта на кривата дава представа за степента на миокарден инфаркт, отразяващ количеството некротична миокардна тъкан. Активността в кръвта на СС и СС-МВ се увеличава вече със смъртта на 1 g миокардна тъкан.

Еднократно проучване на AST, KK или LDH има сравнително ниска клинична специфичност - 66%, повишавайки активността на ензимите или съдържанието на протеинови маркери за 3-4 часа повишава органоспецифичността на диагнозата до 86%, а третото измерване позволява да се диагностицира миокарден инфаркт, като се използва дори такъв малко специфичен тест. дефиниция на AST. Динамичното изследване на маркерите на смъртта на миоцитите дава възможност за диференциална диагноза между миокарден инфаркт и хиперферемия при масивно увреждане на набраздените мускули. В периоди от 8-24 часа след пристъп на стенокардия, активността на ензимите е толкова показателна, че ако няма динамично увеличаване на тяхната активност в кръвта, тогава няма миокарден инфаркт.

Не са открити абсолютно специфични маркери за кардиомиоцитни увреждания. Органоспецифичността в диагнозата с помощта на QA изоензими се основава единствено на разликата в процентното съотношение на изоензимите в отделните органи и тъкани и следователно в кръвния серум, когато те са повредени.

Стойността на QC-MB. KK-MB изоензимът е специфичен за миокарда не защото няма такъв изоензим в други тъкани, а защото неговата активност в кардиомиоцитите е 15-42% от общата QC активност, докато съдържанието му в скелетната мускулна тъкан не надвишава 4%, и само в червени, бавно свиващи се мускулни влакна. При тези условия, с поражението на миокарда и скелетните мускули, активността на СС може да се увеличи до същата степен, но в проценти активността на СС-МВ ще се различава значително. При миокарден инфаркт, съдържанието на CK-MB надвишава 6% от общата активност на CK или 12 IU / l при температура от 30 ° C.

Както в патологията на скелетните мускули, така и в смъртта на кардиомиоцитите в кръвта, KK-MB активността се увеличава, но в първия случай активността му няма да надвишава 6% от KK активността, а във втория случай ще се увеличи до 12-20%. Препоръчително е активността на QC-MB да се изразява едновременно в единици от 1 литър (IU / l) и като процент от активността на QC. Определянето на KK-MB активността остава най-популярният тест при диагностициране на миокарден инфаркт. При миокарден инфаркт при пациенти в напреднала възраст, активността на QC може да бъде увеличена в малка степен, но със значително увеличение на активността на QC-MB. При такива пациенти е диагностично важно да се изследва активността на СК-МВ, дори и при не толкова значително повишаване на активността на СК.

По време на операции на сърцето (сърдечни дефекти, коронарен байпас), QC-MB активността се използва за диагностициране на постоперативен миокарден инфаркт. Непосредствено след операцията, поради хипоксия и увреждане на миокарда, KK-MB активността в кръвта се повишава и се връща към нормалното в рамките на 10-12 часа.С развитието на миокарден инфаркт, KK-MB активността се увеличава по-значително и има динамика, характерна за миокарден инфаркт.

Стойността на LDH. LDH активност₁ характеристика на миокарда като тъкан с анаеробен тип обмен. В условията на миокардна хипертрофия и хронична хипоксия, синтез на LDH₁ в кардиомиоцитите започва да се увеличава. При миокарден инфаркт се наблюдава повишаване на каталитичната концентрация на LDH в кръвта поради увеличаване на

съдържание на LDH изоензими₁ и LDH₂ в съотношение LDH₁/ LDG₂ повече от 1. LDH - цитозолен ензим; Значително повишаване на активността на LDH в кръвта по време на миокарден инфаркт настъпва по-късно от QC и AST, в продължение на 1 ден при ангина; висока активност на LDH₁ продължава 12-14 дни. Като тест се използва намаляването на активността на LDH в кръвта към нормалното, което показва завършване на периода на резорбция на некротизираната миокардна тъкан. Ако активността на LDH₁, определено по директен метод, с инхибиране на субединицата с М антитела надвишава 100 IU / l, това е надежден знак за миокарден инфаркт.

За разлика от М субединицата и изоензимите на LDH₃ (MMNN) LDH₄ (HMMM) и LDH₅ (MMMM) субединица Н и LDH изоензим₁ (IUUH) в по-малка степен LDH₂ (НННМ), могат да използват не само лактат и пируват, но и α-хидроксибутират като субстрат. Това беше в основата на предложението за оценка на активността на LDH₁ в кръвта, като се използва а-хидроксибутират като субстрат; докато изозимът LDH₁ наричани α-хидроксибутират дехидрогеназа (α-HBDG). При миокарден инфаркт, проучване на активността на общия LDH и α-HBDG дава сходни резултати. Ако активността на LDH в кръвта се повиши в резултат на друг патологичен процес, активността на LDH ще бъде значително по-висока от активността на LDH.₁ и α-HBDG при отсъствие на динамика, характерна за миокарден инфаркт.

При миокарден инфаркт няма значима корелация между KK-MB и LDH активността.₁ във всички термини на инфаркта, което се случва в резултат на значителна разлика в динамиката и времето на повишаване на активността на тези изоензими в кръвта.

Молекулите ензими, които са влезли в кръвта след смъртта на кардиомиоцитите, са патологични компоненти на кръвната плазма и следователно трябва да бъдат отстранени. В зависимост от размера на маркерните молекули, някои протеини, например миоглобин, се екскретират в урината или фагоцитните клетки на моноцит-макрофаговата система. Обаче, преди молекулите СК-МВ и СК-ММ да се фагоцитират от макрофагите, те се подлагат на последователно действие на протеази в кръвта, което води до образуването на СК-МВ и СК-ММ изоензими.

В миоцитите, KK-MM изоензимът е представен от единична форма на ММ-3. В кръвта карбоксипептидазата последователно разцепва крайните аминокиселинни остатъци на лизина от всеки от двата мономера, като последователно образува изоформи ММ-2 и ММ-1. Определяне на KK-MM и KK-MB изоформи по метода на EF и изчисляване на тяхното съотношение

позволяват до 1 час да се установи времето на смъртта на кардиомиоцитите. Съотношението на MM и MB изоформи се променя преди повишаване на KK-MB активността.

Ензимодиагностика на миокарден инфаркт в клинични диагностични лаборатории е сложна. Първо се определя активността на AST, KK и LDH, след това се изследва активността на KK-MB и LDH₁. Интегрираният подход към ензимната диагностика се дължи, на първо място, на факта, че при изследване на активността на един ензим може да се направи грешка; второ, всеки от тези ензими се различава по диагностична значимост и динамика (времето на поява в кръвта и скоростта на елиминиране от съдовия слой). В допълнение към неточностите, които могат да бъдат направени при преаналитичния (вземане на кръвни проби за анализ) и аналитичните етапи, съществуват обективни причини, които влияят на резултатите от определянето на активността на ензимите. Трудности възникват, когато инфарктът на миокарда се развива на фона на тежки соматични заболявания, с инфаркт на миокарда, усложнен от кардиогенен шок, със септицемия.

Въпреки клиничната специфичност на активността на QC за миокарден инфаркт (98%), в някои случаи не е възможно да се установи повишаване на активността на QC и QC-MB дори при условията на проверка на диагнозата миокарден инфаркт според ЕКГ данните. Това се случва в случаите, когато инфарктът се развива на фона на бъбречна недостатъчност и натрупване на уремични токсини (средномолекулни пептиди), при пациенти с чернодробна цироза и дефицитна детоксикационна активност на хепатоцитите, със септицемия и ендогенна интоксикация с изразена метаболитна (или дихателна) ацидоза. При тези условия такъв голям брой неспецифични инхибитори се натрупват в кръвта, че активността на QC и QC-MB е практически неопределена. В такива случаи, е възможно да се определи активността на QC само след процедурата за разреждане на серума, непопулярна в клиничната биохимия, когато намаляването на концентрацията на инхибиторите позволява да се прояви активността на ензима.

Наличието на KK и KK-MB инхибитори в кръвта доведе до разработването на имунохимичен метод за определяне в кръвта не на каталитичната активност, а на KK-MB съдържанието по молекулно тегло на тази форма. Това значително подобри чувствителността на метода и възпроизводимостта на резултатите. Въпреки че с неусложнен миокарден инфаркт, KK-MB активността и KK-MB съдържанието на протеин корелират добре,

възможно е да се определи съдържанието на QC-MB в кръвта няколко часа преди активния ензим. Значително повишаване на нивото на CK-MB белтък в кръвта е отбелязано при половината от пациентите вече след 3 часа, а 6 часа след пристъп на ангина пекторис, високо ниво на протеин е отбелязано при всички пациенти с клинична картина на миокарден инфаркт. Вече 90 минути след тромболиза се повишава нивото на KK-MB протеин в кръвта няколко пъти. При пациенти с нестабилна стенокардия по-често се наблюдава повишаване на съдържанието на CC-MB протеин, отколкото повишаване на активността на изоензима. В същото време, въпреки производството на диагностични комплекти от различни компании, въпросът за стандартизиране на метода за определяне на броя на QC-VM не е окончателно решен.

Стойността на гликоген фосфорилазата. Сред маркерите на ензима и изозима при диагностицирането на миокарден инфаркт клиничните биохимици определят активността на GF и неговия изоензим GF-BB. GF е цитозолен ензим, който катализира отстраняването на глюкоза от гликоген в клетка.

В човешките тъкани има три GF изоензима: GF-LL в черния дроб, GF-MM в миоцити и GF-BB в мозъчната тъкан. В човешкия миокард съществуват GF-BB и GF-MM изоензими, в миоцитите на скелетните мускули - само GF-MM. GF-BB е най-чувствителният тест за диагностициране на миокарден инфаркт през първите 3-4 часа след пристъп на ангина. Според диагностичната чувствителност в първите часове, определянето на GF активност може да се сравни само с определянето на KK-MB маса в кръвта. При по-голямата част от пациентите нивото на GF-BB значително се повишава след 4 часа след пристъп на ангина и с неусложнен миокарден инфаркт се връща към нормалното в рамките на 48 часа.

Стойността на миоглобина. Сред белтъчните маркери на миокарден инфаркт, най-широко използваното определение в кръвта е съдържанието на миоглобин (MG). MG е хромопротеин, който в цитозола на всички мускулни клетки транспортира кислорода основно до митохондриите. Молекулната маса на MG е само 18 kD; неговите свойства са сходни в миоцитите и кардиомиоцитите на скелетните мускули. MG е постоянно присъстващ в кръвната плазма при концентрация под 80 ng / ml. При инфаркт на миокарда нивото на МГ в кръвта се повишава 10-20 пъти.

• Повишен MG в кръвта - най-ранният тест за диагностициране на миокарден инфаркт; увеличаване на нивото на MG в кръвта може да се определи след 3-4 часа след пристъп на ангина. Това е първата диагностична стойност на MG.

• Втората особеност на MG при диагностициране на миокарден инфаркт е, че такава малка молекула свободно преминава през филтрационната бариера на бъбречните тела и бързо се оказва в урината. Това определя естеството на промените в съдържанието на MG в кръвта: бързо се увеличава и намалява. Само при определяне на MG е възможно да се диагностицират рецидивиращи миокардни инфаркти (фиг. 4.2), които се развиват няколко часа след първия епизод на смъртта на кардиомиоцитите. В допълнение, в редица клинични наблюдения, са наблюдавани значителни колебания в нивото на MG в кръвта на 1-ия ден от миокарден инфаркт, когато значително увеличение за няколко часа отстъпи на еднакво изразено намаление. Situations В някои ситуации нивото на MG в кръвта остава дълго време постоянно високо. Това се наблюдава при кардиогенен шок, когато намаляването на контрактилната функция води до хипотония, спад в хидростатичното налягане над бъбречната мембрана и прекратяване

Фиг. 4.2. Динамика на концентрацията на миоглобин в кръвта след повторен пристъп на ангина пекторис

гломерулна филтрация, когато MG не може да се филтрира в урината. В същото време има положителна корелация между съдържанието на MG в кръвта, което корелира положително с повишаване на нивото на креатинина.

Основната структурна контрактилна единица на миоцита е саркомерът, който се образува от подредени дебели и тънки влакна. Тънките влакна съдържат актин и тропонин-тропомиозиновия комплекс.

Стойността на тропонин. Регулаторният комплекс тропонин в набраздените мускули се състои от три полипептида; При диагностициране на миокарден инфаркт, в кръвта се определя съдържанието само на тропонин Т (Tn T) и тропонин I (Tn I). Всеки протеин има три изоформи, синтезът на които е кодиран от три различни гена. Миокардните изоформи на Tn T и Tn I (сърцето Tn T и сърцето Tn I) се използват като специфични маркери за смъртта на кардиомиоцитите.

Определянето на съдържанието на TnT позволява диагностицирането на инфаркта и в ранните, и в късните периоди. Съдържанието на TnT в кръвта се повишава след няколко часа след пристъп на ангина. В ранните стадии на инфаркта на миокарда клиничната чувствителност на определянето на миоглобин и KK-MB съдържанието е по-висока от Tn T, но от третия ден нивото на Tn достига плато, което продължава с постепенно намаляване за 5-6 дни. Нивото на Tn се оказва високо в тези периоди на неусложнен миокарден инфаркт, когато нивото на миоглобин и KK-MB активност вече се е върнало към нормалното, а в кръвта остава само висока активност на LDH.₁. В някои случаи, когато се определя TnT, диагнозата миокарден инфаркт може да бъде направена на по-късна дата - 8-10 дни след ангинална болка. Особено важно е да се изследва TI при пациенти, които са били приети в болницата 2-3 дни след пристъп на ангина, когато KK и KK-MB показателите вече могат да се върнат на първоначалното си нормално ниво. В допълнение, в сравнение с KK и KK-MB, съдържанието на TnT в кръвта се увеличава в по-голяма степен, което характеризира по-високата диагностична чувствителност на определянето на съдържанието на Tn Т в кръвта.

Сравнително изследване на Tn T и Tn I разкрива по-висока диагностична чувствителност на Tn I. Така нивото на Tn I в кръвта по време на миокарден инфаркт може да бъде почти 100 пъти по-високо от горната граница на нормата. При малък миокарден инфаркт, нивото на Tn I в кръвта се повишава в по-голяма степен, отколкото активността на СС,

Таблица 4.1. Сравнителни характеристики на сърдечните серумни маркери

Процент или съотношение QC-MB / общо. QC 6 Времето от началото на болезнената атака зависи от метода

KK-MB и LDG₁. Определянето на двете форми на Tn T и Tn I е за предпочитане при диагностициране на миокарден инфаркт, който се развива в следоперативния период и след активни реанимационни мерки.

Няма идеален маркер за кардиомиоцитен статус (Таблица 4.1). При диагностицирането на миокарден инфаркт, клиничните биохимици са склонни да използват най-специфичните за органа изоензими и идентифицират белтъчни маркери, съдържащи само миокардни клетки. Въпреки това, за диагностициране на миокарден инфаркт в лабораториите продължават да се определят и MG. Въпреки това, при неусложнен миокарден инфаркт, динамиката на неспецифичния MG в кръвта на практика повтаря тази на кардиоспецифичния СК-МБ, която е с 4-6 часа преди това.В същото време опитите за определяне на съдържанието на МГ в урината за диагностициране на миокарден инфаркт не са успешни.

4.2. БОЛЕСТИ НА ЖИВОТА

Въпреки многото биохимични процеси в чернодробните клетки, не всички от тях имат диагностична стойност. Това се дължи на ограничените методологични възможности на лабораторията, ниското ниво на познания за патофизиологията на черния дроб, както и еднопосочните промени в редица биохимични тестове.

Доминантната стойност в лабораторната диагностика на чернодробно заболяване е определянето на ензимната активност. Ензимите, синтезирани от хепатоцити и епителни клетки на жлъчните пътища, могат да се разделят на индикаторни, секреторни и екскреторни. Секреторните ензими включват холестераза, активността му в кръвта при чернодробни заболявания намалява поради нарушение на неговия синтез. Чрез екскреторните ензими се включват алкална фосфатаза, GGT и PAWS. Най-голямата група диагностично важни ензими са индикаторни ензими, включително ALT, AST, LDH и GLDH. В раздела. 4.2 показва посочените ензими и тяхното вътреклетъчно разпределение.

Широко разпространена в диференциалната диагноза на чернодробно заболяване е получен метод за сравняване на степента на повишаване на активността на ензимите с различна локализация в хепатоцитите и отразяване на различните страни на функционалната активност на клетъчните лезии. Най-използваното съотношение на ензимите е представено в таблица. 4.3.

Таблица 4.2. Чернодробни ензими

Таблица 4.3. Съотношението на чернодробните ензими

За чернодробни заболявания използвайте коефициента De Ritis (съотношение на AST / ALT активност). АСТ / ALT съотношение повече от 2 е типично за индуцирани от алкохол лезии и по-малко от 1 за вирусен хепатит и холестатичен синдром. В повечето случаи на вирусен хепатит съотношението AST / ALT остава под 1. При вирусен хепатит активността на ALT се увеличава десетократно. При остър алкохолен хепатит активността на AST е по-висока от ALT, докато активността на двата ензима не надвишава 500-600 IU / L. Пациенти с токсичен хепатит, инфекциозна мононуклеоза, интрахепатална холестаза, цироза, чернодробни метастази, инфаркт на миокарда АСТ активност е по-висока от активността на АЛАТ. Активността на АЛАТ и АСТ се увеличава при приемането на еритромицин, пара-аминосалицилова киселина, диабетна кетоацидоза, псориазис, използва се и за ранна диагностика на анитеричен хепатит.

В диференциалната диагноза на патологията на черния дроб е важно да се изследват съотношенията на активността на LDH изоензимите. Увеличението на относителната активност на LDH изоензима₅ характеристика на лезии на хепатоцити. LDH хиперферметемия се наблюдава в различна степен при остър вирусен, лекарствен и хипоксичен хепатит, сърдечна недостатъчност, цироза на черния дроб и екстрахепатален холестаза, както и намаляване на осмотичната резистентност на еритроцитите и хемолиза. Дългосрочно повишаване на активността на LDH изоензимите₅ и LDH₄ предполага наличието на чернодробни метастази.

В момента при диагностицирането на чернодробни заболявания, стабилността на колоидните системи все още се оценява чрез тимол и сублиматни тестове. Патологичните резултати отразяват ранните периоди на остър хепатит, токсично увреждане на черния дроб, обостряне на хроничния хепатит. ESP протеините в кръвния серум също дават неспецифични данни, но позволяват да се прецени естеството на патологичния процес. Процентът на албумин, остри фазови протеини и γ-глобулини помага при диагностицирането на чернодробната патология: нисък албумин и високи нива на γ-глобулини са характерни за цироза на черния дроб. Повишените кръвни нива на γ-глобулините се откриват и при мастна инфилтрация на черния дроб, възпаление на жлъчните пътища и злокачествено заболяване.

Съдържанието на албумин в серума има диагностична стойност при остри и хронични форми на хепатит. При всички случаи на остър хепатит нивото на албумин в кръвта остава нормално.

Хроничният хепатит е придружен от хипоалбуминемия и хипергамаглобулинемия.

Черният дроб е централната връзка в регулацията на кръвосъсирването. Хепатоцитите синтезират фибриноген, много активатори и инхибитори на каскада от ензимни реакции. Както остър, така и хроничен хепатит нарушават това регулиране. Диагностичните тестове за чернодробно заболяване включват удължаване на протромбиновото време, натрупването в кръвта на продуктите от разрушаване на фибриногена. Острото чернодробно увреждане е придружено от повишено кървене в условията на хипофибриногенемия.

Нарушената функция на черния дроб е придружена от промяна в метаболизма на LP. Хипертриглицеридемията е характерна за различни форми на чернодробна патология. Хиперхолестеролемията често се появява, когато жлъчните пътища са блокирани и обструктивна жълтеница. При хроничен хепатит, свободният холестерол се натрупва в кръвта в резултат на намаляване на естерификацията му в кръвния поток. При условия на силно изразена холестаза се наблюдава образуването на холестатични макроскопични форми LP-LP-X, които образуват комплекс от LP с фрагмент от плазмената мембрана.

В повечето случаи на чернодробно заболяване, етиологичният фактор остава извън обхвата на диагнозата и клиничните биохимици формират диагноза въз основа на принципите на синдромната диагноза.

Основните патологични процеси, които формират лабораторната диагноза на заболяването, са следните синдроми:

• интрахепатална и екстрахепатална холестаза;

• токсични лезии на хепатоцити;

• недостатъчност на синтетичните процеси в хепатоцитите;

• забавяне на инактивирането на токсични съединения;

Синдром на цитолиза. Патофизиологичната основа на синдрома на цитолизата е нарушение на целостта на плазмената мембрана на хепатоцитите и техните органели с развитието на хиперферемия. Тежка хиперфертемия, когато цитозолните ензими навлизат в кръвния поток, е характерна за инфекциозен хепатит, лекарствено и токсично увреждане на черния дроб, отравяне, декомпенсирана цироза и перифокално възпаление на паренхима при холангит. В ензимодиагностиката на синдрома на цитолиза доминира дефиницията

АЛТ, АСТ и LDH дейности. Обикновено активността както на ALT, така и на AST в кръвта не надвишава 24 IU / l; в рамките на 100 IU / L, хиперферментацията се счита за “сива зона”, която може да се дължи на реактивни промени в хепатоцитите. Активността на ALT над 100 IU / l показва увреждане на чернодробния паренхим. Увеличаването на активността на АЛАТ в 100-200 пъти (до 2-6 хиляди IU / l) отразява голямото увреждане на хепатоцитите при вирусен хепатит и отравяне с органични разтворители.

Синдром на интрахепатална и екстрахепатална холестаза. Синдромът на интрахепаталния холестаза определя нарушаването на изтичането на жлъчката от черния дроб. Увеличаването на обема на хепатоцитите води до компресия на жлъчните пътища, нарушена функция на дрениране. Обтурацията на големите жлъчни пътища е причина за екстрахепатална холестаза; най-изразена холестаза с обструктивна жълтеница. В раздела. 4.4 показва комбинацията от лабораторни тестове, които най-често се използват за диференциалната диагноза на холестазата.

Таблица 4.4. Диагностика на холестаза

Надеждни маркери на интрахепаталния холестазен синдром са повишаване на активността на ALP, GGT и 5-нуклеотидаза в кръвта. В епителната мембрана на жлъчния канал, ензимите са разположени близо един до друг, следователно, с разрушаването на мембраните, тяхната активност в кръвния поток се увеличава едновременно и еднакво.

Реактивните промени в епитела на жлъчните пътища и плазмените мембрани на хепатоцитите се оценяват въз основа на активността на алкалната фосфатаза. Активността на алкалната фосфатаза помага при диференциалната диагноза на интрахепаталната и екстрахепаталната холестаза. При екстрахепатална обструкция (камъни на жлъчните пътища, неоплазма на Vater papilla), алкалната фосфорна активност се увеличава 10 пъти или повече. Интрахепатална обструкция при паренхимни лезии (хепатит) е придружена от

е увеличение на активността на алкалната фосфатаза с 2-3 пъти. Острата некроза на хепатоцитите не може да бъде съпътствана от повишаване на активността на алкалната фосфатаза, ако това не предизвиква компресия на жлъчните пътища (интрахепатална холестаза). Не всички патологични процеси в черния дроб наблюдават зависимостта между активността на алкалната фосфатаза и хипербилирубинемията. В ранните стадии на интрахепаталната холестаза повишаването на активността на алкалната фосфатаза е следствие от активирането на неговия синтез; по-нататъшното му увеличение е свързано с разрушаването на жлъчните каналикули под действието на жлъчните киселини.

Синдром на вътреклетъчна холестаза. Увеличаването на размера на хепатоцитите и тяхното компресиране на жлъчните пътища между сегментите на черния дроб води до поява на вътреклетъчен синдром на холестазата с умерено повишаване на активността на алкалната фосфатаза и GGT в кръвта и увреждане на епитела на жлъчните пътища. Увеличаването на кръвното съдържание на жлъчните киселини е също ранен симптом на холестазата.

Често срещан симптом на чернодробно заболяване, придружен от холестаза, е натрупването на билирубин в кръвта. Тежестта на хипербилирубинемията е ненадеждна за диференциалната диагноза на интрахепаталната и екстрахепаталната холестаза. В същото време хипербилирубинемията има прогностична стойност. Увеличението на нивото на билирубина е пет пъти типично за интрахепатален холестаза, повишаването на концентрацията на билирубин е 10 пъти по-характерно за острия хепатит.

Синдромът на токсично увреждане на хепатоцитите се развива, например, по време на алкохолна интоксикация, когато липсват ефектите на цитолизата, но алкохолът нарушава функцията на митохондриите.

При остра алкохолна интоксикация се развива синдром на токсично увреждане на субклетъчните образувания и целостта на плазмените мембрани в хепатоцитите не е компрометирана. Алкохолните метаболити имат токсичен ефект, по-специално ацеталдехид, който се образува директно в митохондриите. В същото време, образуването на високоенергийни съединения, по-специално АТФ, е нарушено в клетката, което има патологичен ефект върху детоксикационните процеси на токсични съединения. В острия период на алкохолен хепатит активността на AST може да доминира в кръвта поради високата активност на митохондриалния изоензим AST, а не на цитоплазмата.

Включването на хепатоцитите в патологичния процес на митохондриите е съпътствано от появата на GlDG активност в кръвта. Повишената GlDG активност е ранен алкохолен хепатитен тест, но 8-10-кратно увеличение на активността на GlDG с умерено активиране на AST и ALT е характерно за обструктивна жълтеница. За токсични

ефектите на алкохола се характеризират с ясно изразено увеличение на GGT активността в кръвта без значително повишаване на алкалната фосфорна активност.

Синдромната недостатъчност на синтетичните процеси се проявява в намаляването на синтеза на хепатоцитните транспортни протеини, протеините на кръвосъсирващата система, СЕ.

HE и неговите изоензими синтезират хепатоцити. В условията на паренхимна лезия се намалява синтеза на ХЕ и неговата активност в кръвта. По-често се наблюдава намаляване на КЕ в кръвта в резултат на токсични ефекти (цитостатици, инсектициди, фунгициди, флуориди). Физиологичният спад в активността на ХЕ възниква по време на бременност. Отбелязани са редки случаи на генетично определено намаляване на синтеза на ХЕ.

При остра чернодробна недостатъчност, хипогликемия се развива при всеки четвърти пациент. При условия на натрупване на междинни метаболити и развитие на инсулинова резистентност е възможна и появата на хипергликемия. При продължителна чернодробна недостатъчност настъпва хиперинсулинемия (намаляване на унищожаването на хормона в черния дроб). При условия на хипоксия и активиране на анаеробна гликолиза се образува метаболитна ацидоза с натрупването на млечна киселина в кръвта (лактатна ацидоза). Метаболитна ацидоза води до нарушаване на съотношението на електролитите. Поражението на чернодробния паренхим е съпроводено с намаляване на образуването на креатинин и урея. Естествено, неадекватен прием на протеини и нарушения в храносмилането допринасят за това. Въпреки това, основната причина за хипокреатининемията е намаляване на синтеза на креатинина в хепатоцитите. При пациенти с хепатит хипокреатининемията се свързва с намаляване на нивото на пикочната киселина в кръвта.

Синдромът на забавяне на инактивирането на токсични съединения се дължи на инхибирането на тяхното хидроксилиране в микрозомалния апарат на хепатоцитите, което намалява скоростта на инактивиране в организма на много лекарства. При тези условия, дори ниска терапевтична доза от лекарството може да предизвика изразен страничен ефект.

Черният дроб служи като биологична бариера на ендогенни и екзогенни токсични съединения, които основно идват от стомашно-чревния тракт. Оценката на детоксикационната функция на черния дроб се извършва по-често с хронични лезии, като се използват стрес-тестове с галактоза, фенолтетрабромофталин сулфонова киселина, бромоцианово зелено, маркирани съединения. Тестовете за натоварване предоставят възможност за диагностициране на хронични форми на заболяването, за да се оцени

остатъчни ефекти от прехвърлен хепатит, за да формират представа за функцията на черния дроб при цироза, мастна инфилтрация на черния дроб.

При тежки случаи на чернодробна кома с остър вирусен хепатит или портална хипертония, детоксификационната функция на черния дроб се оценява въз основа на количеството амоняк в кръвта. Образуването на амоняк в червата става постоянно в резултат на жизнената активност на микроорганизмите и деаминирането на аминокиселини, образувани от хранителни протеини. На фона на масивно кървене от стомаха или вените на хранопровода се наблюдава повишено образуване на амоняк от кръвния албумин.

Възпалителният синдром се причинява от активирането на RES клетки. Характеризира се с повишаване на кръвното съдържание на протеините в острата фаза, диспротеинемия в нарушение на съотношението на серумните протеини върху електрофореграма, промяна в седиментните проби (тимол), повишаване на концентрацията на имуноглобулини.

Въпреки разнообразието на тези нарушения, използването на синдромни диагностични техники е ефективно още в ранните стадии на чернодробно заболяване. Естествено, резултатите от биохимичните изследвания в диагностичния процес не са уникални. В същото време клиницистите използват данни от анамнеза и физически преглед, резултати от радионуклидна диагностика, компютърна томография и биопсия на черния дроб. В същото време, диференциалната диагностика в ранните стадии на заболяването и оценката на естеството на увреждането на хепатоцитите могат да се правят само въз основа на лабораторни тестове, предимно клинични биохимични данни. Използваните комбинации от лабораторни изследвания са представени в Таблица. 4.5.

Таблица 4.5. Диагностика на чернодробни заболявания чрез ензими

4.3. Патология на костната тъкан

Основните фактори, регулиращи метаболизма на фосфат и калций, включват ПТХ, калцитонин и витамин D. ПТХ и калцитонин поддържат калциевото постоянство в съдовото легло и извънклетъчната течност, влияят върху абсорбцията на калций в червата, реабсорбцията в бъбреците, червата и отлагането в костната тъкан. ПТХ регулира калция в кръвта, засягайки абсорбцията на калций в червата и бъбречните тубули, мобилизирането на калция от костната тъкан. Калцитонинът има по-малко значим ефект, намалявайки активността на остеокластите, повишава активността на остеобластите, което води до намаляване на калция в кръвта.

РТН е полипептид, чиято единствена верига се състои от 84 аминокиселинни остатъка. Хормонът секретира паращитовидни жлези, вероятно под формата на неактивен прекурсор, от който се образува активният хормон чрез разцепване на полипептидния фрагмент. Активният РТН има кратък полуживот, което създава проблеми за анализа: като се използва радиоимунологичен метод, карбокситерминалният фрагмент на хормона се измерва главно, който има по-дълъг полуживот, но е биологично неактивен.

Когато действа върху бъбреците, ПТХ потиска реабсорбцията на фосфор в проксималните и дисталните тубули на нефрона, повишавайки неговата екскреция и съответно понижавайки нивото на фосфора в кръвта (хипофосфатемия). В същото време, хормонът увеличава калциевата реабсорбция на калция, особено в дисталните тубули на нефрона. Действието на РТН в костната тъкан води до мобилизиране на калций и фосфат, допринасяйки за появата на остеопороза и хиперкалциемия. Хипокалцемията с отрицателна обратна връзка е основният стимул за секрецията на ПТХ, докато хиперкалцемията потиска образуването на хормона от паращитовидните жлези. РТН също повишава абсорбцията на калций и фосфор в червата, стимулирайки синтеза на 1,25-дихидроксихолекалциферол.

В случаи на хиперсекреция на ПТХ с паратиреоиден аденом се развива изразена остеопороза, с наличието на

хиперкалциемия и хипофосфатемия и повишена екскреция на калций и фосфат в урината. При тези условия фосфатната реабсорбция в тубулите е инхибирана и следователно нейната екскреция се увеличава, фосфатният клирънс се увеличава с появата на хиперкалциемия в условията на костна резорбция с развитието на остеопороза. Можете да потвърдите диагнозата чрез определяне на концентрацията на ПТХ в кръвта. В случаите, когато хипофосфатемия е придружена от хиперкалциемия, дори умерено повишаване на съдържанието на хормони е диагностично важно.

Трябва да се има предвид, че при някои форми на тумори на белите дробове, бъбреците, яйчниците се образува ектопична ПТХ в туморните клетки. Сред тези състояния е необходимо да се диференцира формата на рахит, устойчив на витамин D. Това рядко срещано наследствено заболяване, свързано със секса, се нарича синдром на Фанкони. Последното се характеризира с висока екскреция на фосфор в урината едновременно с глюкозурия и аминоацидурия без поява на ацидоза в кръвта.

При хронична бъбречна недостатъчност може да възникне активиране на синтеза на РТН като компенсаторен механизъм в развитието на хипокалцемия и хиперфосфатемия. Вторичен хиперпаратироидизъм се наблюдава и при остеомалация, причинена от значително намаляване на абсорбцията на калций в червата с повишена екскреция.

Това патологично състояние се развива най-често като усложнение на операцията на щитовидната жлеза, когато паращитовидните жлези се отстраняват по погрешка. В този случай нивото на калция в кръвта е толкова ниско, че се развиват специфичните симптоми на хипокалцемия и хиперфосфатемия (симптоми на Khvostek и Trusso), отделянето на калций и фосфор с урината намалява. Това състояние изисква незабавно интравенозно приложение на калциев хлорид.

В клиничната картина на псевдохипопаратиреоидизъм, промяната в нивата на фосфат и калций в кръвта е подобна на тази на първичен хипопаратиреоидизъм, но в същото време се увеличава съдържанието на ПТХ в кръвта. Това състояние

характеристика на генетично заболяване (болест на Олбрайт), свързана с неспособността на бъбречните тубулни клетки да реагират на хормон.

Вторият хормон, който регулира метаболизма на фосфор и калций е калцитонин. Едноверижен пептид с 32 аминокиселинни остатъци секретира парафоликуларни клетки на страничните дялове на щитовидната жлеза. Този хормон инхибира мобилизацията на фосфат и калций, докато тяхното съдържание в кръвта намалява (хипокалцемия и хипофосфатемия). Ефектът на хормона върху бъбреците не е добре разбран; Предполага се, че калцитонин увеличава екскрецията на фосфати с тубула. В допълнение, хормонът инхибира стимулиращия ефект на РТН върху синтеза на 1,25-дихидроксихалоалкалфестерол.

РОЛЯ НА ВИТАМИН D

Третият фактор, който активно влияе върху метаболизма на калция и фосфора в костната тъкан е витамин D. Синтезът на витамин D в организма се осъществява в два етапа на хидроксилиране: първият се появява в черния дроб, за да образува вещество с ограничена биологична активност; вторият етап се случва в бъбреците с образуването на витамин D₃, холекалциферол с максимална биологична активност. Витамин D в тънките черва₃ стимулира абсорбцията на фосфор и калций, в проксималните части на тръбната част на нефрона активира реабсорбцията на двата йона. Фактори, които активират синтеза на витамин D₃ в бъбреците е намаление на съдържанието на фосфор в кръвта и ефектът на ПТХ.

В условията на дефицит на витамин D, поради намаляване на съдържанието на неговите мастноразтворими прекурсори в храната, недостатъчно ултравиолетово облъчване на кожата или малабсорбция, в кръвта се забелязва изразена хипофосфатемия. В отговор на повишаване на секрецията на ПТХ се повишава абсорбцията на калций и фосфати в тънките черва и мобилизирането на минерали от костната тъкан. За определен период от време това нормализира съдържанието на калций в кръвта, но концентрацията на фосфор може да остане намалена поради инхибиране на нейната реабсорбция от паратиреоидния хормон.

При хронична бъбречна недостатъчност се развива синдром на бъбречна остеодистрофия - комплексно нарушение на метаболизма на костната тъкан и фосфор-калциевата хомеостаза. Намаляване на гломерула

филтрацията произвежда хиперфосфатемия, хипокалцемията се развива с намаляване на бъбречния синтез на витамин D и резистентност към неговите ефекти. Хиперфосфатемията може да допринесе за развитието на хипокалцемия, поради намаляване на абсорбцията на калций в тънките черва, поради образуването на неразтворими апатити.

МЕТАБОЛИЧНИ БОЛЕСТИ ЗА КОСТНИ ТЪКАНИ

Метаболитните костни заболявания се разделят на остеопороза, остеомалация, остеодистрофия, остеогенеза и остеопороза. Болестите на костите могат да се развият и на фона на друга патология, като акромегалия или ектопична калцификация в съдовата стена (с атеросклероза и нормална с образуването на "мозъчен пясък" в епифизата).

Остеопорозата е най-честата метаболитна костна болест. Остеопорозата е типична за много заболявания, характеризиращи се с генерализирана загуба на костна тъкан, която надвишава възрастовите и половите стандарти и води до намаляване на здравината на костите, което причинява податливост на фрактури (спонтанни или с минимални наранявания). Остеопорозата трябва да се различава от остеопенията (свързана с възрастта атрофия на костната тъкан) и остеомалация (нарушена минерализация на костната матрица).

Рисковите фактори за остеопороза включват принадлежност към раса от бяла или монголоидна раса, семейно предразположение, телесно тегло под 58 kg, тютюнопушене и алкохолизъм, ниска или прекомерна физическа активност, ранна менопауза, късно начало на менструация, аменорея и безплодие, продължителна лактация (повече от 6 месеца) повече от три бременности и раждане в репродуктивна възраст, както и злоупотреба с кафе (повече от пет чаши на ден), липса на прием на калций от храната и продължително парентерално хранене.

Клиничната картина в повечето случаи се развива постепенно, обикновено в продължение на няколко години. При лабораторната диагностика е важно да се определи нивото на алкална фосфатаза (може да се увеличи временно след фрактури), калций и фосфати (обикновено нормални). Костната резорбционна активност се определя от съотношението на калциевото ниво в урината към нивото на урината и съотношението на съдържанието на хидроксипролин в урината към нивото на креатинина в урината. Рентгеновото изследване на гръбначния стълб показва намаляване на костната плътност с акцентуация

кортикални контури. Външният вид на рентгенограмата на такива отклонения е възможен само при загуба на поне 30% от костната тъкан.

Остеомалацията е скелетна патология, която се появява, когато органичната матрица на костите е недостатъчно минерализирана. При деца това е рахит (вж. По-долу), при възрастни, метаболитни нарушения на калций, фосфор и витамин D.

Рахит - заболяване от ранно детство, в резултат на дефицит на витамин D, характеризиращо се с промени в костната тъкан с развитието на скелетни деформации. Всички патофизиологични процеси са причинени от хипокалцемия в резултат на дефицит на витамин D и неговите метаболити. Възниква компенсаторна активация на паращитовидните жлези и хиперпродукция на ПТХ, която мобилизира отделянето на калций от костите и увеличава абсорбцията на калциеви и фосфатни соли в червата. Настъпват хипофосфатемия, метаболитна ацидоза и остеогенеза.

Деформиращата остеодистрофия (деформираща остеита, болестта на Paget) е наследствено заболяване, характеризиращо се с деформация на бедрената и тибиалната кости, гръбначния стълб и черепа с тежка хиперостоза, удебеляване и изкривяване на костите, повишена честота на тумори. Обикновено се случва на възраст над 50 години. Клиничната картина обикновено е асимптоматична, като най-честата проява е болка в костта или ставата. По-рядко се забелязват костни деформации, главоболие, патологични фрактури, повишаване на телесната температура над засегнатия крайник, сърдечна недостатъчност с висока сърдечна дейност и различни неврологични нарушения, дължащи се на компресия на нервната тъкан (с увреждане на черепа, най-често от тях глухота). Лабораторията се характеризира с повишаване на алкалния фосфор и остеокалцин в остеосклеротичната фаза, увеличаване на нивото на хидроксипролин в остеолитичната фаза. Серумният калций и фосфор обикновено са нормални.

Бъбречна или уремична, остеодистрофия е често увреждане на костите, подобно на остеомалация, рахит или фиброзен остеит; хронична бъбречна недостатъчност.

Наследствената остеодистрофия на Олбрайт се дължи на резистентността на клетките-мишени към действието на ПТХ (псевдохипопаратиреоидизъм). Пациентите с псевдохипопаратиреоидизъм са резистентни към други хормони, действащи чрез аденилатциклазната система.

(тироиден стимулиращ хормон, глюкагон, FSH, LH). При тези пациенти се наблюдава характерен фенотип, проявяващ се с брахидактилия, нисък ръст, подкожна осификация. Болестта на Олбрайт често се комбинира със захарен диабет, артериална хипертония, затлъстяване, менструални нарушения (олигоменорея), артериит, полиартроза. Също така се характеризира с умствена изостаналост и конвулсии (поради хипокалцемия).

Несъвършена остеосинтеза е наследствено заболяване, което причинява намаляване на костната маса (поради нарушение на остеогенезата) и причинява повишена чупливост; често съпътствано от синя оцветяване на склерата, аномалии на зъбите (несъвършена дентиногенеза) и прогресивна загуба на слуха. Ултразвукът разкрива тежки форми на плода от 16-та седмица на бременността. Диагнозата е възможна с помощта на ДНК проучвания в проби от биопсия на хорионна вилица. Симптоматично и ортопедично лечение.

Остеопорозата и остеосклерозата са колективни и на практика идентични понятия, характеризиращи относителното увеличение на съдържанието на костна тъкан на костите, което води до намаляване на обема на кухините на костния мозък с неизбежно увреждане на хемопоезата.

Мраморна болест. Известни са няколко наследствени форми: доминиращата наследствена болест на Алберс-Шьонберг и рецесивните форми са злокачествени, доброкачествени и летални форми. Честота всички форми - приблизително 1: 20,000 Клинично остеопетроза в тази патология проявява множество фрактури, остеомиелит, хиперостоза черепа, хроничен ринит поради стесняване на носните проходи, хепатоспленомегалия (причинени от изравнителната екстрамедуларна хематопоеза), лицевия нерв парализа, анемия (причинена от намаляване на обема на костния мозък) и лаборатория - чрез повишаване нивото на алкална фосфатаза.

4.4. МАРКИРОВЕ НА МАЛИЧНО РАСТЕЖ

Няма съмнение, че успехът на лечението на рака може да се очаква само когато се открият злокачествени тумори в ранен стадий на развитие, но въпросът за своевременното откриване на признаци на такива патологии все още остава отворен.

През последните години диагностичните възможности на клиничните онколози значително се разшириха във връзка с използването на съвременни инструментални диагностични методи: ангиопатия и лимфография, радионуклидна диагностика, компютърна

термо- и рентгенови томографи, радиомагнитен резонанс, ултразвук с доплеров ефект, които позволяват да се получи цветно изображение на тумора и да се преценят особеностите на микроциркулацията. Съвременните имуноморфологични и цитологични изследвания позволяват изследването на биопсични проби не само на самия тумор, но и на различни секрети (слюнка, урина, асцитна течност). В момента комплексна лабораторна биохимична и имунологична диагностика се основава на идентифициране на туморни маркери, хормони, биологично активни съединения, ензимни изоформи, както и метаболити на костно ремоделиране при метастатични костни лезии.

Началото на изследването на туморните маркери е много окуражаващо. Още в края на 19-ти век в урината на пациенти с множествен миелом са открити специфични протеини (имуноглобулини), наречени протеини Bens-Jones, но следващият успех трябва да изчака повече от 80 години. Тя е свързана с откриването на GI. Абелев и Ю.С. Татарин α-фетопротеин в кръвта на пациенти с хепатом. Тези проучвания отбелязаха началото на нов етап в изследването на факторите, свързани с растежа на злокачествени тумори, а през ХХ век доведе до откриването на серия от различни съединения, наречени „туморни маркери“. Маркерите се използват широко от клиничните биохимици за идентифициране на първичния тумор и неговите метастази. Маркерите за злокачествен растеж включват вещества от различно естество. Те включват повече от 200 съединения: антигени, хормони, ензими, гликопротеини, липиди, протеини, метаболити, чиято концентрация корелира с туморната маса, неговата пролиферативна активност и в някои случаи със степента на злокачественост на неоплазма. Анормалната експресия на генома е един от основните механизми за производство на маркери от туморни клетки, който определя синтеза на ембрионални, плацентарни и ектопични протеини, ензими, антигени и хормони.

Като идеален тест за ранна диагностика на злокачествени тумори са предложени много маркери, но досега не е намерено решение. Трудности поради разнообразието от изисквания за идеален маркер. Идеалният туморен маркер трябва да се произвежда от туморната клетка в достатъчни количества, така че да може да се определи с помощта на съвременни методи. Не трябва да присъства при здрави хора и при доброкачествени тумори,

маркерът трябва да бъде открит в ранните стадии на туморния процес, броят на туморния маркер трябва да бъде право пропорционален на обема на тумора, този маркер трябва да се определи преди клиничните прояви на тумора, нивото на идеалния маркер трябва да корелира с резултатите от антитуморното лечение.

При клиничните проучвания се използват редица достатъчно ефективни туморни маркери, които обаче не винаги напълно отговарят на всички горепосочени критерии. Съвременните биохимични и имунологични методи могат да разкрият тумори, когато условният брой туморни клетки достигне 10 9 -10 10, а минималното ниво на маркер, отделен от тумор, е от един до няколко фемтомола (всички цифри са базирани на 1 ml кръвен серум). Високата ефективност на използването на туморни маркери в клиниката може да се постигне чрез комбинация от различни тестове. Трябва да се отбележи, че броят на предложените маркери за диагностика и мониторинг на злокачествени тумори непрекъснато се увеличава и настъпва етап на критична преоценка с цел формиране на стратегия и адекватна употреба.

4.4.1. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ НА РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ ИЗПИТВАНЕТО НА ТУМОРНИ МАРКЕРИ

Определянето на концентрацията на туморни маркери в различни неоплазми изисква познаване на факторите, както in vivo, така и in vitro, които влияят върху резултатите или ги нарушават. Това трябва да се вземе под внимание не само от лекари от лабораториите, но и от лекари, които са пряко отговорни за процеса на наблюдение и лечение на конкретен пациент. Следните са основните фактори, влияещи върху определянето на туморните маркери.

• степента на изразяване и синтеза на маркера;

• маркерно освобождаване от туморни клетки;

• медикаментозни и химиотерапевтични лекарства;

• екскреция от тялото;

• интензивност на кръвоснабдяването на тумора;

• Положението на тялото на пациента по време на кръвната проба;

• методи на инструментални и неинструментални изследвания (например, бронхоскопия или биопсия);

• катаболизъм на туморен маркер (например функционално състояние на черния дроб и бъбреците);

• лоши навици (пушене, пиене на алкохол). In vitro:

• условия за съхранение на проби;

• интервала от време между събиране на кръв и центрофугиране (с отделяне на серума);

• степен на хемолиза и жълтеност;

• контакт на кръвоносните съдове с кожата;

• замърсяване на пробата със слюнка;

• влияние на наркотици;

• наличие на антитела към миши имуноглобулини в кръвта на пациентите (след диагностична имуносконтиграфия и имунотерапия);

• методологична грешка при определяне на туморния маркер. Необходимо е да се има предвид, че по-голямата част от тях циркулират

маркерите на кръвния тумор са неподходящи за скрининг на пациенти при липса на симптоми, тъй като има редица ограничения, свързани с често ниската диагностична чувствителност и специфичност, както и ограничената прогнозна стойност. В същото време, има редица признати случаи, когато е трудно да се управлява без дефиницията на туморни маркери.

Това е, на първо място, оценката на ефективността на терапията. В ранните стадии, промените в концентрацията на туморния маркер могат да покажат дали избраната химиотерапия ще бъде успешна или (в случай на постоянно увеличение на концентрацията) корекция на терапията е необходима, до отмяна. Разбира се, тестването на туморен маркер е абсолютно безсмислено при тежки случаи на рак.

Второ, наблюдение на хода на заболяването. Използването на туморни маркери за проследяване на хода на неоплазма често прави възможно откриването на метастази и / или рецидив на тумора в продължение на 3-5 месеца или повече преди клиничните прояви на заболяването. При някои пациенти тестването на туморни маркери след хирургично отстраняване на мястото на първичния тумор може да осигури по-чувствителен мониторинг от ендоскопията, ултразвуковото изследване или компютърната томография. Скоростта на увеличаване на нивото на тумора

маркер обикновено ви позволява да направите заключение по редица наблюдения

- естеството на прогресирането на заболяването, по-специално, за метастази. Познаването на естеството на промените в нивото на туморния маркер също ви позволява да оптимизирате времето на последващото подробно изследване на пациента. Докато се поддържа ниско или нормално ниво на туморен маркер за достатъчно дълго време, последващото изследване, включително инвазивни или скъпи техники, изглежда излишно. Напротив, ако нивото на туморни маркери се увеличава и информацията за прогресирането на заболяването е необходима, когато се взема решение за тактиката на лечение, такива изследвания са показани.

Трето, идентифициране на остатъчни и рецидивиращи тумори. Недостатъчно слабо понижаване на нивото на туморен маркер или отсъствието на намаление обикновено показва непълно отстраняване на тумора или наличието на множество тумори (метастази). Тази информация може да има терапевтично и прогностично значение.

И накрая, на четвърто място, предсказването на хода на туморния процес. Това е изключително интензивно развиваща се съвременна област на приложение на туморни маркери, по-специално тези, чието изследване е свързано с прогнозата и съответно основно влияе върху избора на терапия.

4.4.2. ЦВЕТЕН РАК

В европейските страни ракът на дебелото черво (КР) се разболява

1 от 20 души. По-рядко този вид рак се среща в Африка и части от Азия. Сега в Русия степента на откриване на КРС се повишава монотонно.

Понастоящем използването на молекулярни методи при диагностицирането на CRC се счита за многообещаваща и важна област на изследването, което се дължи на факта, че събития, настъпващи на ниво геном, трябва да се считат за ключови при появата и прогресията на тези тумори. Съществуват редица надеждни факти, показващи, че КРС на ранен етап на развитие може и трябва да бъде идентифицирана чрез молекулярни методи. Методите за молекулярна диагностика на КРС също ви позволяват да предпишете адекватно лечение и да предскажете резултата доста точно.

CRC се развива като резултат от последователни промени (дисплазия / аденома-аденокарцином), които се основават на генетични

нарушения. Обаче механизмите, отговорни за появата и натрупването на такива нарушения в епителната клетка, не са напълно разбрани. Пример за трудностите при изучаването на този проблем е фактът, че има разлики в честотата на поява на доброкачествени и злокачествени фази на заболяването, а именно в дисплазия / аденома-аденокарциномна последователност. Доказано е, че колоректалните аденоми се срещат при повече от половината от населението до 9-то десетилетие на живота, а КРР се развива само в 5% от населението. Следователно, само някои от предраковите промени се трансформират в рак.

Така, наред с старостта и хроничните възпалителни заболявания (улцерозен колит, болест на Крон или повлияване на дебелото черво при шистосомоза), КРС в кръвните роднини е признат, ако не и основен рисков фактор. Причините, които причиняват CRC в един член на семейството, могат да варират от редки автозомно доминантни синдроми с висока честота на CRC (фамилен аденоматозен полипоз, наследствен не-полипозен CRC синдром) до по-малко генетично ясни състояния, като например откриване на аденом в най-близкото роднини (родител, брат или сестра). Известно е, че КРС се появява в по-млада възраст, колкото по-голям е статистическият риск от неговото възникване сред близки роднини. Наследствени синдроми на CRC са представени в таблица. 4.6 според фенотипа и мутациите в съответните гени.

Трябва да се отбележи, че изследването на молекулярните механизми, залегнали в редки наследствени синдроми, допринася за разбирането на патогенезата на спорадичната CRC, която се наблюдава много по-често в популацията, но въз основа на подобни или подобни молекулярни събития.

Интензивното изследване на ролята на молекулярно-генетичните нарушения във външния вид на КРС и по-специално на геномната нестабилност се наблюдава сравнително скоро. През 1993 г. е открита микросателитна нестабилност (MSI) в членове на семейството с наследствен рак на дебелото черво (RTC). Това откритие послужи като основа за хипотезите на мутаторния фенотип на рак, издигнат от Леб, според който една клетка трябва да оцелее в различни мутации, за да стане ракова. Но за това първоначално трябва да има възможност да мутира по-често от нормалното и това на свой ред може

Таблица 4.6. Наследствени синдроми CRC

Таблица 4.7. Видове генетични нарушения и молекулярни маркери в CRC

да се свърже с инактивирането на механизмите, отговорни за нормалното запазване на структурата на ДНК.

В почти всички случаи на RTK се отбелязва хромозомна нестабилност или MSI нестабилност. Всъщност между тези две нарушения има обратна връзка. Така, злокачествените тумори, които имат MSI нестабилност, обикновено са диплоидни и нямат хромозомни аберации. Туморите с хромозомна нестабилност се характеризират с анеуплоидия и често са придружени от загуба или поява на допълнителни хромозоми. Честото откриване на хромозомна нестабилност или MSI нестабилност в този случай не показва, че това е много често срещано и неспецифично явление в процеса на началото на всеки злокачествен тумор, но че нестабилността на генома е тясно свързана с туморогенезата.

Както хромозомната нестабилност, така и MSI нестабилността могат да бъдат открити в най-ранните стадии на RTK. Така, използвайки сравнителна хибридизация на генома за определяне на средния брой грешки при копиране, успяхме да покажем тяхното постепенно нарастване с прогресията на аденом с лека дисплазия до аденом с тежка дисплазия и последваща трансформация в рак (Таблица 4.8).

Таблица 4.8. Хромозомна нестабилност в случай на RTK

Пациенти с наследствена предразположеност, дължаща се на APC генни нарушения, включително нарушения на нуклеотидната последователност и генна експресия, развиват тумори, обикновено развиващи се в резултат на хромозомна нестабилност, която се характеризира с загуба на алели и цитогенетични нарушения. Тумори при някои пациенти с спорадичен КРС възникват по същия начин.

За разлика от това, при пациенти с наследствен CRD синдром на неполипоза, мутациите в генно-корегиращите грешки на ДНК водят до тумори, характеризиращи се с MSI нестабилност и нуклеотиди, открити като повторни нуклеотидни последователности, някои от които са разположени в кодони на гените. Рядко се наблюдава загуба на алели. Този тип молекулярна патология се наблюдава и при около 15% от случаите на спорадична CRC и често се свързва с анатомични особености, като например местоположение в проксималния дебел (възходящо дебело черво); ниска диференциация на туморни клетки със слуз, медуларен или криоидно-клетъчен компонент; наличието на значителен брой лимфоидни фоликули с зародишни центрове по периферията на тумора; лимфоцитна туморна инфилтрация.

Неефективната транскрипция на гени в резултат на аберантно метилиране на цитиращи гуанинови последователности (C-G острови) в промоторни области на гени понастоящем се разглежда като един от компонентите на молекулярната патогенеза на третия CRC подвид.

Използването на молекулярно-диагностични методи при пациенти има голям потенциал както в ранната диагностика и оценка на туморния отговор на терапията, така и в прогнозата на заболяването. Както е показано в таблицата. 4.9, с такава диагноза, можете да използвате различни обекти на изследване.

При тези пациенти, които вече имат CRC, могат да се използват молекулярни методи за идентифициране на микрометастази, за по-точно оценяване на етапа на туморния процес, по-специално за откриване на микрометастази в лимфните възли, или за оценка на възможното хематогенно разпространение на туморни клетки в костния мозък.

Освен това, молекулярната диагностика има голям потенциал за откриване на генотипни и фенотипни характеристики на тумора, които определят цялата верига от събития, водещи до метастази на клетките, т.нар.

Таблица 4.9. Използване на молекулярно-диагностични методи за CRC

генотип и фенотип. Маркери от този тип биха могли да показват по-голяма вероятност от прогресиране на туморния процес след радикална операция.

Идентифицирани са генетични аномалии, свързани с прогнозата или отговора на химиотерапията за CRC, включително загуба на алел при 18q, изчезване на експресията на DCC генен продукт, аномалии в гена p53, загуба на алели върху късата ръка на хромозома 1 и 5, RAS мутации. Изследванията на клиничната ефикасност на използването на такива молекулни маркери са убедително формулирани, в момента се провеждат и включват представителна проба от населението. За широко използване в клиничната практика, молекулярните маркери трябва да отговарят на всички изисквания за рутинни лабораторни тестове, като възпроизводимост, наличност и адекватен качествен контрол. Накрая, резултатите от изследванията на молекулярните маркери трябва лесно да се интерпретират от лекарите и да имат терапевтична стойност.

Сложността и многостепенните генетични и биохимични процеси, протичащи в раковите клетки, които им позволяват да метастазират, затрудняват интерпретирането на стойностите на такива маркери. Освен това, факторите, които не са пряко свързани с тумора, като качеството на хирургичната техника, оказват съществено влияние върху крайния резултат. Сред гените на туморните маркери, които предсказват терапевтичен отговор, вниманието е фокусирано върху р53 и на регулирани от апоптоза гени, които се регулират от р53.

Една от областите на молекулярно-генетичното изследване на туморите е идентифицирането на молекулярни нарушения, характерни за по-късното развитие на метахронни тумори, понякога погрешно считани за рецидив на основния тумор. Такива проучвания включват изследване на колоректални аденоми като цел за идентифициране на маркерния ген поради тяхната висока честота в популацията като предракова промяна в сравнение с ниската честота на откриване на злокачествени тумори. Молекулярният маркер, показващ висока вероятност за развитие на метахронни аденоми, по-специално аденоми, способни да се трансформират в злокачествен тумор, може да бъде полезен за идентифициране на рискови групи за последващо колоноскопично скриниране.

За разлика от тях, пациентите, при които е малко вероятно метахронните аденоми да напредват, могат да бъдат изключени от скрининга. Стратегията за отстраняване на аденома е показала, че тя е свързана с намаляване на честотата на CRC и молекулни маркери, които идентифицират пациенти с по-висок риск, могат да бъдат полезни.

Изследването на проби от изпражнения и кръв също има голям потенциал. По този начин използването на много прост тест за скрита кръв в изпражненията намалява смъртността от CRC, но неговата специфичност остава сравнително ниска. Молекулярните тестове за откриване в изпражненията на туморни ДНК фрагменти са по-прогресивни. Редица проучвания показват, че ДНК съдържащи мутации могат да бъдат идентифицирани в изпражненията и кръвта на пациенти с тумори с тези мутации. Диагностика на тумори, скрининг и динамично наблюдение на пациентите може значително да се подобри, ако се преодолеят някои технически трудности и разходите за тях са балансирани.

В момента изследователите обръщат голямо внимание на изучаването на перспективите за използване на молекулярно-генетични маркери на КРС. По-долу е представена кратка характеристика на туморните маркери, които сега най-често се използват в клиничната практика.

За първи път, рак-ембрионален антиген (CEA) е открит през 1965 г. от Gold и Freedman в изследване на човешка стомашно-чревна тъкан и аденокарцином на дебелото черво. По-късно СЕА се открива в серума на пациенти с CRC. Тези първи работи бяха много окуражаващи. Тогава на мнозина това изглеждаше

високоспецифичен тест за диагностициране на RTK. По-късно обаче, когато методите за откриване на СЕА и натрупването на клинични данни се подобриха, този маркер можеше да бъде изолиран и при други тумори (рак на панкреаса, черния дроб, белия дроб, щитовидната жлеза и невробластома), както и при неопластични заболявания (чернодробна цироза, улцерозен колит, панкреатит, хроничен бронхит, емфизем, вирусен хепатит, дивертикулит, полипи, бъбречна недостатъчност). Ето защо е невъзможно при откриването на СЕА напълно точно да се каже, че пациентът има този вид рак. В същото време, СЕА е все още първият маркер за избор на КРС и се използва с висока ефективност при наблюдението на заболяването, но основното внимание се обръща на количествените параметри на метода.

При 99% от здравите хора нивото на СЕА е под 5 ng / ml. С CRC чувствителността на теста варира от 25 до 80% и зависи от размера и степента на диференциация на тумора, както и от степента на процеса. Нивото на СЕА корелира със стадия на туморния процес. Така, според обобщени данни на различни автори, в съответствие с етапите според класификацията на Дюкс, за антигена е характерно повишаване на неговата концентрация: на етап А - 7.8 ng / ml, В - 30.3 ng / ml, С - 58.1 ng / ml, D - 134,3 ng / ml. В същото време, честотата на откриване на СЕА (при маркерния праг от 5 ng / ml) в групите пациенти с посочените етапи се повишава и съответства на 3, 25, 45 и 65%, а при праговата стойност на маркер> 2,5 ng / ml се открива още по-често при горните. Dukes-етапи и съответства на 28, 45, 75 и 84%. Предвид факта, че на етап А и В туморният маркер се увеличава само при 3-28% от пациентите, употребата му при ранната диагностика на КРС е проблематична. Силно диференцираните тумори произвеждат СЕА по-активно.

Според много автори, маркерът има прогностична стойност, която се крие във факта, че високо начално ниво на СЕА в кръвния серум (повече от 25 ng / ml) показва висок риск от развитие на ранен рецидив на CRC след хирургично отстраняване на тумора.

Един пример за използването на СЕА е определянето на радикалния характер на хирургичната интервенция в КРС. Като правило, след радикално хирургично отстраняване на тумора, до края на 6-тата седмица, концентрацията на антигена става по-ниска от нормалната. Ако нивото на маркера не спада след отстраняването на първичния тумор,

да мисля, че пациентът има метастази. Препоръчва се да се определя CEA при пациенти в следоперативния период след 3 месеца в продължение на 2 години. Редовният мониторинг на пациентите с КРС с включването на СЕА подобрява 5-годишната преживяемост. Адювантна химиотерапия (5-флуороурацил и левамизол) при пациенти с CRC може да причини преходно повишаване на нивото на СЕА в кръвния серум. Не се препоръчва рутинно да се определя CEA при проследяване на отговора на терапията, но няма алтернативни тестове за оценка на отговора на лечението при пациенти с CRC.

В по-голямата част от пациентите с RTK (79,1%), в сравнение с контролната група (10%), са открити IgM и IgG антитела към СЕА, което също позволява използването на този индикатор като диагностичен маркер и независим прогностичен фактор. В същото време, откриването на антитела към СЕА в серума на пациенти с КРС е свързано с по-добра прогноза и значително увеличение на 2-годишната преживяемост.

Анализът на нивото на СЕА в измиването на дебелото черво преди ендоскопското рутинно изследване показва, че този прост тест може да бъде полезен в практическата медицина за идентифициране на групи пациенти с висок риск от CRC.

Използването на СЕА за диагностични цели е ограничено от неговата ниска специфичност, поради повишаване на концентрацията на серумния антиген при не-неопластични заболявания, както и от ефекта на някои екзогенни и ендогенни фактори върху синтеза на този маркер. Следователно, при изследване на пациенти с тумори на дебелото черво, CA-19-9 се използва като маркер на втория избор (виж по-долу). Това е от особено значение в случай на REA-негативни неоплазми.

Като се има предвид ниската чувствителност и специфичност, също така не се препоръчва да се използва дефиницията за CEA при скрининг на КРС. В случай на 5-кратно увеличение на СЕА в серума и наличието на клинични оплаквания при пациент, трябва да се предложи КПР.

Сравнителен анализ на три туморни маркера (СА-19-9, СЕА и α-фетопротеин) в серума на пациенти с РТК на различни етапи на туморния процес, при пациенти с хроничен улцерозен колит и при здрави хора разкри значителна разлика между пациенти с локализирана РТК и хронична улцерозен колит по отношение на СА-19-9 и СЕА, както и между локализиран и генерализиран RTK за горните два

туморни маркери. Стойностите на туморните маркери при хроничен улцерозен колит не надвишават тези в нормалните. В локализиран процес нивото на СА-19-9 не надвишава 1000 единици / ml, СЕА - 20 ng / ml. Параметрите на α-фетопротеините при пациенти с КРС са в нормалните граници и обикновено се повишават, само когато туморният процес е генерализиран, което не позволява използването на този маркер при диагностицирането на заболяването. Когато се използва комплекс CA-19-9 + REA, диагностичната чувствителност е 91% и значително надвишава тази при използване само на един туморен маркер. Присъединяването към инструментални методи за диагностика на данни за дефиницията на туморни маркери (СА-19-9 и СЕА) увеличава честотата на откриване на локализирана КРС с 14%, а при обобщаване на процеса - с 9%.

За тумори, характеризиращи се с дисбаланс между процесите на пролиферация и апоптоза. Ендотелин-1, полипептид с 21 аминокиселинни остатъка, има вазоконстрикторна и митогенна активност и също участва в механизмите на регулация на апоптозата. Експериментът показа, че ендотелин-1 е фактор на оцеляване и е способен in vitro да защити PTK клетки от FasL-индуцирана апоптоза.

Честотата на откриване и нивото на разтворим Fas антиген (sFas) - инхибитор на апоптоза - в серума на пациенти с RTK е по-висока, отколкото при практически здрави хора. Има тенденция към повишаване на серумното съдържание на sFas при пациенти с RTK с метастази в регионалните лимфни възли и черния дроб, което дава възможност да се обсъди ролята на Fas / FasL системата като възможна цел за антитуморна терапия при пациенти с CRC.

Беше показано, че високата активност на каспаза-3 корелира с висок риск от рецидив на RTK, особено в случаите на десно-едната й локализация. Също така е открита корелация на активността на каспаза-3 с CD57 + клетки за филтриране на тумори.

Важна роля в механизмите на регулация на апоптозата в РТК играе bcl-2, който обикновено се експресира от клетки, покриващи дъното на криптите на дебелото черво. Доказано е, че експресията на bcl-2 в В-етап RTK Dukes е свързана с по-добро оцеляване на пациентите и, съответно, за пациенти, при които туморите не експресират bcl-2, е препоръчително да се извърши адювантна терапия.

Експресията на имунореактивния р53 в първичния тумор в CRC е маркер на висок риск от рецидив на заболяването след хирургично отстраняване на заболяването и по-често след първата година на наблюдение. В същото време повишена експресия на р53 се открива в 47, а СЕА в 34,4% от туморите. Смята се, че при оценката на прогнозата на КРС е необходимо да се дефинират и двата маркера.

Известно е, че генетичните увреждания разграничават първичните карциноми на проксималната и дисталната колона. По този начин, многовариантният анализ на експресията на р53 в първичната CRC по-често показва повишена експресия на р53 в дисталната (58,5%), отколкото проксималната (41,7%) RTK. В същото време периодът без рецидив е по-малък при р53 + тумори (75 и 38%, съответно, р = 0.006). Беше отбелязан висок риск от рецидив на CRC при р53 + тумори с тяхната дистална локализация. Следователно, оценката на експресията на р53 в CRC може да служи като маркер за ранна рецидив на заболяването и е свързана с локализацията на тумора в органа.

Доказано е, че неуспехът на химиотерапията в CRC е свързан с мултирезистентността на тези тумори. Показано е, че експресията на различни изоформи на CD44 е свързана с агресивно поведение на тумора и повдига въпроса дали сигналът от този рецептор модулира лекарствената чувствителност на тумора. Доказано е също така, че CD44 индуцира активиране на LYN и Akt src семейства на тирозин кинази. Способността за потискане на апоптозата може да играе решаваща роля в развитието на тумори на дебелото черво, което е свързано с експресията на CD44.

Плазмаминогенни активатори и инхибитори

През последните години изследването на металопротеинази на извънклетъчната матрица, които са тясно свързани с процесите на инвазия и метастази на тумори, привлече вниманието на изследователите. С развитието на метастазите трябва да има верига от последователни събития, водещи до освобождаване на туморни клетки от тяхната оригинална среда и образуването на туморни възли в отдалечени органи и тъкани. Предполага се, че за да се осигурят процесите на инвазия и метастази, е необходима комплексна протеолитична верига, включваща различни протеази. Счита се, че плазминът, който намалява нивото на извънклетъчните матрични гликопротеини и активира някои прометалопротеази, играе решаваща роля в процесите на инвазия и метастази, докато

в многоетапна протеазна верига серин протеазата е ключова позиция - урокиназен тип плазминогенен активатор (uPA), тъй като катализира образуването на плазмин от неговия предшественик плазминоген. IRA рецепторът (Pc-uPA) също играе важна роля, тъй като, когато iPA се свързва с рецептора, неговата способност да активира плазминогена се увеличава. От друга страна, инхибитори на uPA-PAI-1 и PAI-2 могат да присъстват в РТК тъканите. Показано е, че нивата на uPA и PAI-1 в CRC са по-високи, отколкото в хомоложни нормални тъкани и доброкачествени тумори.

Въпросът дали iPA в човешки RTK се получава от самите ракови клетки или от елементите на заобикалящата строма (фибробласти, макрофаги, левкоцити) остава без отговор за дълго време. Накрая, Harvey et al. възможно е да се докаже, че активаторът произхожда от самите ракови клетки и не е заимстван от елементите на стромата, а антигенът е най-интензивно открит в апикалните и базалните области на PTK клетките.

Най-представителното изследване на компонентите на плазминогенната активационна система в CRC проби е проведено от Fujii et al. Те също така анализираха експресията на uPA и PAI-1 гените, използвайки PCR метода. Експресията на UPA се открива в 58,8% от туморите. При пациенти с положителен uPA и отрицателни резултати за PAI-1, 5-годишната прогноза за преживяемост е значително по-лоша. Многовариантният анализ показа, че резултатите от едновременното определяне на uPA и PAI-1 в CRC са независими прогнозни показатели.

Преживяемостта на пациентите след операцията не корелира с съдържанието на uPA в туморната строма, но се отбелязва модел, свързан с неговото ниво в туморния епител, т.е. определянето на нивото на uPA може да бъде тест за диагностициране на RTK без метастази, както и риск от ранен рецидив. след операция. Възможно е протеазите да бъдат насочени с лекарства, които предотвратяват инвазията и метастазите на CRC.

Чернодробните метастази са важен фактор, който ограничава прогнозата при пациенти с RTK. Съществува връзка между iRA и чернодробните метастази. Трансдукцията на tPA гена в PTK клетки може да бъде полезна от гледна точка на противодействието на чернодробните метастази.

Най-малко проучени в клиничния смисъл, компонентът на плазминогенната активационна система се счита за Rc-uPA, който е мембранно свързан тридомен гликопептид. това

рецепторът може също да съществува в разтворима форма (rRc-uPA) в екстракти от тумор, както и в кръвната плазма на здрави хора и пациенти с рак. Разтворимата Rc-uPA в плазмата е практически непроменена молекула, но нито точния механизъм на неговото освобождаване от клетъчната повърхност, нито неговата биологична функция са напълно проучени. Повишени нива на rRs-uPA в плазмата се откриват при пациенти с RTK и концентрацията на rRs-uPA се свързва с прогнозата на заболяването. Възможно е Pc-uPA да има значителен принос за повишаване на ангиогенезата около тумора, както и за микроваскуларните метастази.

Така, повишената експресия на Rc-uPA, която характеризира инвазивната способност на тумора in vitro в поне някои субпопулации на RTK клетки, е частично резултат от постоянното активиране на сигналната каскада, зависима от митоген-активирани протеинови кинази.

Рецептори на растежен фактор

Една от важните регулаторни системи за митогенна сигнална трансдукция е семейството на тирозин киназните рецептори - продукти от c-erbB групата на онкогени, която включва четири трансмембранни рецептора с подобна структура - рецептор на епидермалния растежен фактор (EPRF или ErbB1), както и ErbB2 (HER2 / neu) ErbB3 (HER3) и ErbB4 (HER4). В допълнение към структурата, тези рецептори се различават по относителна специфичност и афинитет за различни общи лиганди. След активиране в резултат на свързване на лиганда и димеризация, вътрешната рецепторна тирозин киназа се активира и придобива способността да фосфорилира както самия рецептор, така и други клетъчни протеини, участващи в предаването на митогенния сигнал.

Различни фактори на растежа участват в автокринната и паракринната регулация на пролиферацията на CRC клетки. През последните години клиничното значение на рецепторите на растежния фактор и техните лиганди е активно изследвано в CRC, предимно RESR, рецептор на инсулиноподобен растежен фактор тип 1 (RIGR-1), рецептор на съдов ендотелен растежен фактор (R-VEGF).

REFR е c-erbB1 онкогенен продукт, който е трансмембранна тирозин киназа, най-изследваната в клинична гледна точка маркер на тази група в тумори с различна локализация, но недостатъчно изследвана в CRC.

Рецепторите на семейството ErbB могат да образуват както хомо-, така и хетеродимери, а в много случаи хетероструктури с участието на втория представител на това семейство, HER2 / neu, който няма свой собствен лиганд, са най-активни. По този начин, HER2 / neu е ключов елемент в предаването на митогенни сигнали на EGF-подобни растежни фактори и неговото блокиране може значително да забави или да спре растежа на тумори, които са зависими от такива стимули. Смята се, че повишената експресия на HER2 / neu в туморите, включително CRC, може да служи като маркер за чувствителност и цел за по-ефективна биотерапия на тези тумори. Провеждат се клинични проучвания и в литературата са представени предварителни проучвания за експресията на HER2 / neu в прогнозата на тумори на стомашно-чревния тракт.

RIFR-1 и RIFR-2 са потенциални митогени и силни стимулатори за растеж на туморни клетки. Ефектите, стимулиращи растежа на двата вида FGID, се медиират, главно от FGED-1. Към днешна дата не съществува единно мнение за клиничната стойност на RIFR-1 в CRC.

Повечето проучвания показват обратна връзка между откриването на рецептори на стероидни хормони (ендокринен тип регулация) и EGFR (авто и паракринен тип регулация) в туморите.

Блокирането на всеки от етапите на митогенното предаване на сигнала на растежните фактори може, по принцип, да доведе до нарушена регулация на пролиферацията на туморни клетки и потенциално инхибиране на туморния растеж. Експериментът вече изследва достатъчно голям брой лекарства, които влияят на горните процеси: специфични и неспецифични блокери на свързване на EGFR към лиганди, инхибитори на тирозин киназа и други кинази, блокери на свързване на SH2 домейни на ефекторни протеини с активиран рецептор, съединения, които потискат активирането на ras ген, включително инхибитори на фарнезилиране. Повечето от тях са в етап на клинично проучване, въпреки че някои, по-специално Herceptin, вече са преминали клинични изпитвания и са се доказали като доста ефективни при някои видове тумори.

Известно е, че RTKs са таргетни тъкани на стероидни хормони и в 25-60% от случаите запазват функционалната способност на първичната връзка на механизма на действие на един или няколко стероиди, а именно, естрогенни рецептори (RE; 40,9%), андрогени (RA; 15,5%). ), прогестерон (RP; 32,6%) и глюкокортикоиди (WG; 59,1%).

Въпреки това, само наличието на ER и RP в тумора може да се използва като критерий за благоприятна прогноза за 10-годишната преживяемост на пациенти с КРС. В същото време, повторните ЕГ се откриват по-често при РТК при жените (60,5%), отколкото при мъжете (39,5%), с локализиран стадий на заболяването (63,1%) и тумор в десния край на дебелото черво (59,4%).

Туморни маркери на ангиогенезата

Изследователите са показали голям интерес през последните години към изследването на ангиогенните фактори в тумора и по-специално на VEGF. Налице е нарастващо доказателство, че метастазите на различни етапи на туморния процес зависят от степента на васкуларизация на тумора.

При хематогенни метастази туморните клетки трябва да се прилепят към ендотелните клетки, да преминат в лумена на съда, да оцелеят в циркулиращата кръв, да спрат в определен орган или тъкан и да образуват колония там. Високите ангиогенни първични тумори, включително CRC, с висока интратуморна съдова плътност, вероятно ще произведат ангиогенен клон в отдалечен орган, който при благоприятни условия може да образува метастази. Повечето изследователи смятат, че високата степен на васкуларизация на тумора е статистически значим маркер за наличието на метастази в регионалните лимфни възли. В 77% от предходните проучвания е установена значителна връзка между туморната ангиогенеза и развитието на отдалечени метастази. И въпреки че има значителни разлики в изследваните групи пациенти и методите, използвани за оценка на ангиогенезата, повечето изследователи са показали обратна връзка между васкуларизацията на тумора и оцеляването на пациенти с CRC. В допълнение, недостатъчна васкуларизация и в резултат на това нейната хипоксия увеличават експресията на гени, свързани с резистентност (Pg-гликопротеин, хидрофолат редуктаза) към химиотерапия и представляват важна неефективност на неоадювантна радиация и химиотерапия.

При повечето пациенти (73.4%) с регионални метастази в лимфните възли периодът без рецидив е значително по-висок в отсъствието на VEGF експресия и нисък индекс на SPF (S-фаза) в тумора. В допълнение към прогностичната значимост на VEGF, блокирането на VEGF рецептор-2 е показало, че инхибира растежа на CRC метастази в черния дроб.

Понастоящем повече от 200 съединения имат ангиогенна активност и всички те могат да бъдат разделени на две групи според инхибиторния ефект. Първата група включва съединения, които влияят на трансфера на ангиогенни сигнали от ендотелни клетки (антагонисти на ендотелни растежни фактори, инхибитори на производството на ангиогенни фактори, миграция на ендотелни клетки), а второто - съединения, които влияят на пролиферацията на ендотелни клетки. Най-обещаващите антиангиогенни лекарства като маримастат, батимастат - инхибитори на матрични металопротеинази, SU 6661.

Трябва да се отбележи, че през последните години знанията ни за биологичните процеси, свързани с образуването на нови микросудели в тумора, се увеличиха значително. И въпреки че прогнозните и терапевтични принципи все още се формират, напредъкът в разбирането на патофизиологичните механизми на неоангиогенезата в туморите вече се въвежда в клиничната практика.

Нивото на тимидилат синтетазата в тумора се счита за един от най-ефективните маркери за лекарствена резистентност и прогноза за CRC. Ензимът е необходим за синтеза на ДНК и катализира метилирането на деоксиуридин монофосфат до деокситимидин монофосфат като кофактор за 5,10-метилентетрахидрофолат (5,10-CH2FH4). Известно е, че 5-флуороурацил (5-FU), един от най-широко използваните антиметаболити при лечението на стомашно-чревни тумори, когато се прилага на пациент, образува 5-флуоро-2'-деоксиуридин-5'-монофосфатни форми, които ковалентно се свързват с тимидилатната синтаза, като по този начин блокират Процес на синтез на ДНК в тумора. Изследването на експресивните показатели на тимидилат синтетазата в тумори на пациенти с КРС позволи да се счита за независим прогностичен фактор в тази категория пациенти. В същото време 10-годишните нива на преживяемост са значително по-ниски сред пациентите, при които е открита експресия на ензима в тумора.

Въз основа на ретроспективен мултивариантен анализ и висока степен на надеждност на резултатите, по дефиниция, в експресията на тимидилат синтаза в тумори, този маркер може да се използва в клиниката като независим фактор за прогнозиране за локален рецидив, отдалечени метастази, период без рецидив и обща преживяемост на пациенти с RTK.

Най-добрата прогноза е за пациенти с TRK с ниска експресия на тимидилат синтетаза в първичния тумор. В същото време изследователите убедително демонстрираха, че никакви други прогностични фактори, включително възраст, пол, степен на диференциация на тумора, експресия на p53, не могат да се считат за независими маркери на прогнозата, в частност, рецидив на това заболяване.

Нивото на експресия на тимидилат синтетаза в случай на генерализиран или рецидивиращ CRC може да бъде маркер за чувствителността на тумора до 5-FU. По-често, най-високите нива на експресия на ензима са открити при абдоминални метастази на CRC (82%) в сравнение с метастази на тумор в черния дроб (47%). Смята се, че това трябва да се има предвид при прогнозиране на чувствителността на дисеминираните форми на тумор към 5-FU и индивидуално променяне на химиотерапевтичната стратегия при пациенти.

Показано е също, че експресията на тимидилат синтетаза и тимидин фосфорилаза в тумори на нелекувани пациенти с CRC има не само прогностична стойност при избора на 5-FU химиотерапия заедно с такива пролиферативни маркери като p53 и Ki-67, но също така корелира с показатели за свободна от заболяване и обща преживяемост. В същото време активността на тези два ензима е изследвана чрез биохимичен метод в прясно замразени туморни проби и тяхната експресия е сравнена с имунохистохимичен метод в парафинови участъци заедно с p53 и Ki-67. Установена е също значителна корелация между индекса на ензимната активност на тимидин фосфорилазата и свързващата активност на 5-флуоро-2'-деоксисиридин-5'-монофосфат (5-FU метаболит). Стана известно, че активността на тимидилат синтетазата и тимидин фосфорилазата са тясно свързани с процесите на ангиогенеза и пролиферация в CRC. В същото време, експресията на VEGF корелира значително с активността на тимидин фосфорилазата и Ki-67 индекса в тумора, както и с продължителността на периода без рецидив.

Когато се изследва дихидропиримидин дехидрогеназата, първият ензим, който метаболизира 5-FU до 5-флуородихидроурацил, е установено, че индексът на експресия на този ензим в тумор може да се използва като маркер при оценката на чувствителността на CRC към 5-FU.

Високата активност на индуцираната азотен оксид синтетаза може да служи като маркер за по-агресивен поток на CRC.

Предлага се да се използва високочувствителен и специфичен метод за определяне на теломеразната активност в епителните

CRC клетки, циркулиращи в кръвта. Ензимната активност се открива в 72% от туморите на етапи С и D (класификация на дукесите) CRC. Смята се, че този маркер в този минимално инвазивен метод може да бъде използван в ранната диагностика, прогноза и мониторинг на пациенти с TCR.

Установено е, че повишената експресия на CDC25B фосфатаза в CRC клетки в 43% от случаите показва лоша прогноза за заболяването. Следователно, тези пациенти се нуждаят от адювантна терапия. Смята се, че CDC25B може да служи като независим прогностичен маркер и дори контролни фактори като метастази в регионалните лимфни възли, диаметъра на първичния тумор, степента на неговата диференциация и дълбочината на инвазията. Освен това, нивото на експресия на CDC25B силно показва възможна ранна рецидив на CRC стадии В и С според Dukes.

Наскоро се появиха проучвания, които показват възможността за използване на ензима за синтез на простагландини и ейкозаноиди - циклооксигеназа-2 (COX-2), известен също като простагландин ендопероксид синтетаза - като маркер за ранна диагностика и прогноза на КРС. Експериментални и клинични данни показват важната роля на COX-2 в патогенезата на CRC. Показано е отсъствието на СОХ-2 в епитела на нормалната мукозна мембрана и експресията на протеини в 40% от полипите и 80-90% от злокачествените тумори на дебелото черво, което потвърждава участието на СОХ-2 в неопластичните процеси и в прогресията на CRC. Установена е положителна корелация между експресията на COX-2 и размера на стадия на тумора според класификацията на Dukes. Повишената експресия на COX-2 в RTC се превърна в основа за опитите да се използват неговите инхибитори, по-специално нестероидни противовъзпалителни средства, като профилактични средства, които предотвратяват развитието на CRC и злокачествеността на полипите на дебелото черво. В експерименти с животни е показано, че инхибиторите на СОХ-2 проявяват защитен ефект при колоректална карциногенеза. В допълнение, тези лекарства предотвратяват образуването на нови полипи и допринасят за регресията на съществуващите в дебелото черво. От друга страна, данните от някои експериментални изследвания показват, че антитуморният ефект на нестероидните противовъзпалителни средства се дължи и на факта, че те индуцират апоптоза в PTK клетките и инхибират ангиогенезата в експерименталните тумори.

Други маркери CRC

Накратко, ще се съсредоточим върху някои туморни маркери, чието използване изглежда обещаващо за CRC.

Експресионното ниво на MUC1 в туморите може да се използва като маркер при оценката на прогресията и прогнозата на CRC.

Циклин-зависим инхибитор на киназа Р27 (KIP1) може да се използва като маркер за откриване на ранни стадии на CRC. Обаче, той не може да се използва като маркер за ранното прогресиране на тези тумори.

Също наскоро беше предложено да се използва нов маркер, TA90-IC, който присъства в серума под формата на циркулиращи имунни комплекси, когато се оценява преобладаването на RTK. В основата на изследването е фактът, че според много автори нивото на СЕА е увеличено само при 70% от пациентите в общия стадий на заболяването. Отдалечени метастази са разкрити при 86% от изследваните пациенти, въпреки че много от тези пациенти са имали локализиран тумор без признаци на генерализация на туморния процес. Анализът на нивото на горните маркери показва, че концентрацията на TA90-IC е повишена при 82,9%, а СЕА - само при 70,2% от пациентите. Комбинацията от двата маркера ни позволи да установим разпространението на туморния процес в 93.5% от случаите. Изследователите смятат, че тази работа трябва да се продължи и да се докаже ролята на TA90-IC при скрининга и мониторинга на развитието на CRC.

Трябва да се отбележи, че най-адекватно от клинична гледна точка може да бъде едновременното определяне само на малък брой допълнителни показатели, които могат да характеризират пролиферативната активност на КРС, нейния метастатичен потенциал, чувствителност към различни видове централна и локална регулация. Задачата на изследователите, работещи в тази област, е да изберат оптималната количествено и качествена комбинация от молекулярни маркери в диагностиката, мониторинга и прогнозата на КРС.

4.4.3. РАКОВИ БОЛЕСТИ НА ПАНКРЕЙКАТА, ВЪЗДЕЙСТВИЕТО НА ХРАНИТЕ И ДЪРВЕНИЯ

В Западна Европа, рак на панкреаса се открива в около 10 случая на 100 000. Около 90% от всички тумори.

панкреатичните заболявания са аденокарциноми на каналите и само 5% са невроендокринни неоплазми и ацинарен карцином.

Най-широко използваният маркер при диагностицирането на рак на панкреаса е СА 19-9. Спецификата на нейното определяне варира от 76 до 99%, а чувствителността - от 69 до 93%. Въпреки това, повишената концентрация на СА 19-9 в серума не е специфична само за панкреатични аденокарциноми. Високо ниво на СА 19-9 се открива при други заболявания на стомашно-чревния тракт (остър и хроничен панкреатит, цироза на черния дроб, възпаление на жлъчните пътища).

Показано е, че само 55% от пациентите с рак на панкреаса с диаметър на тумора по-малък от 3 cm имат повишено ниво на СА 19-9 (> 37 U / ml). Следователно, използването на маркер за СА 19-9 в диагностицирането на рак на панкреаса, по-специално в ранните му форми, е ограничено, тъй като неговото ниво се повишава дори и при гореспоменатите доброкачествени процеси в черния дроб и панкреаса. Препоръчва се да се определят индикаторите СА 19-9 за оценка на прогнозата за рак на панкреаса, но не и за рутинната практика.

В перспективни проучвания са изследвани и редица други маркери за рак на панкреаса: CA50, CA242, CA195, DU-PAN 2 муцини, CAM 17.1 / WGA. Въпреки това, понастоящем СА 19-9 трябва да се счита за „златен стандарт” при диагностицирането на рак на панкреаса.

Ракът в стомаха е една от най-често срещаните форми на тумор в света. В Западна Европа честотата му намалява през последното десетилетие, докато в Азия смъртността се увеличава и е приблизително 100 на 100 хиляди, а в САЩ 6 пациенти на 100 хиляди умират от рак на стомаха.

Три маркера са изследвани достатъчно подробно за рак на стомаха: СЕА, СА 19-9 и СА 72-4, но СА 72-4 се счита за най-чувствителен и специфичен. СЕА и СА 19-9 имат една и съща специфичност, въпреки че СА 19-9 може да бъде по-чувствителен от СЕА, но нито един от горните маркери не може да се използва при скрининг и ранна диагностика на рак на стомаха.

Честотата на рак на хранопровода варира значително. Така в Централна Азия честотата им е 50-100 случая на 100 000, а в Европа и САЩ - 2-3 случая на 100 000. В 90% от карцинома на хранопровода е представен от плоскоклетъчен карцином и при по-малко от 10% аденокарцином.

В сравнение с други стомашно-чревни тумори, биохимичните маркери на рака на хранопровода не са проучени достатъчно. Смята се обаче, че SCC и цитокератините (CYFRA 21-1, TPA, TPS) трябва да се считат за най-добрите маркери при диагностицирането на рак на хранопровода от плоскоклетъчен епител, докато СА 19-9 е предпочитан при диагностицирането на езофагеални аденокарциноми. Обаче, туморните маркери при диагностицирането на тумори на хранопровода получават малко внимание поради тяхната неспецифичност.

Друго име за това заболяване е "злокачествен хепатом". Такава диагноза се прави в Западна Европа с честота от 5-10 случая на 100 хиляди, а в Южна Европа по-малко от 5 случая на 100 000. Ракът на черния дроб най-често се открива в Китай, където се препоръчва популационен скрининг на ендемичен фокус на този тумор за откриване на тумори.,

Основният маркер при диагностицирането на хепатоцелуларен карцином е α-фетопротеин, който при скрининг разкрива тумори с малък размер, което допринася за увеличаване на постоперативната преживяемост в тази категория пациенти. Въпреки това, трябва да се отбележи, че ролята на α-FP в скрининга за хепатоцелуларен аденокарцином не е определена от проспективни рандомизирани проучвания. С оглед на много рядкото откриване на тези тумори в Западна Европа, се счита, че не се изисква скрининг на хепатоцелуларен карцином. Въпреки това, от 1986 г. се препоръчва ултразвуково изследване на черния дроб на всеки 6 месеца и определяне на концентрацията на α-AF при пациенти, позитивни за повърхностния антиген на хепатит В, както и на пациентите с хроничен активен хепатит или чернодробна цироза. Смята се също, че пациентите с персистираща инфекция, особено пациенти с вирусен хепатит С, също трябва да се считат за застрашени от хепатоцелуларен аденокарцином. Доказано е, че рискът от развитие на този тумор при вирусен хепатит С и чернодробна цироза е 100 пъти по-висок от този на незаразените.

Един от важните проблеми при използването на α-FP в диференциалната диагноза на хепатоцелуларния аденокарцином са хепатитът и цирозата на черния дроб, при които нивото на туморен маркер също се увеличава. Следователно, отделянето на фукозилирания α-OP от нормалния α-OP чрез свързване към лектини помага при диференциалната диагноза на горните заболявания. Идентифицирането на тези α-OP фракции помага при диференциалната диагноза на хепатоцелуларния карцином. Освен това при доброкачествени заболявания нивото на α-FP може временно да се увеличи, докато при хепатоцелуларния карцином той постоянно се повишава в кръвния серум. Следователно, определянето на α-OP няколко пъти за период от 2-3 седмици позволява да се изключат неговите фалшиво-положителни стойности. Освен това наскоро се появи нов маркер при диагностицирането на хепатоцелуларен аденокарцином - des-gama-carbo протромбин (DCP), известен също като PIVKA II (протеин, индуциран от липса на витамин К). Комбинацията от този маркер с α-FP позволява да се идентифицира хепатоцелуларен карцином при 86% и единствен тумор в 78,3%, и в тези случаи един от тези маркери ще бъде положителен.

4.4.4. НЕФОРМИРАНЕ НА РЕПРОДУКТИВНАТА СИСТЕМА НА ЖЕНИТЕ

Гениталните неоплазми при жените съставляват 15% от всички тумори и се разпределят в зависимост от степента им на упадък в следния ред: рак на тялото на матката, яйчниците и шийката на матката. Въпреки това, в структурата на смъртността ракът на яйчниците е на първо място, следван от рак на маточната шийка и матка. Например в САЩ се регистрират 20 хиляди нови случая на рак на яйчниците и 12 хиляди смъртни случая от този тумор. Етиологията на заболяването е неизвестна, обаче, ановулацията, употребата на някои контрацептиви, както и фамилната чувствителност се считат за рискови фактори.

Повече от 90% от туморите на яйчниците са епителни по природа, т.е. възникват от целомичния епител. Епителните тумори на яйчниците са класифицирани на базата на клетъчен тип: серозен, муцинозен, ендометриоиден, ясна клетка, смесен епителен, недиференциран, сквамозен. Най-често ракът на яйчниците се развива от серозни клетки.

Най-добрият маркер за епителен рак на яйчниците е муцин - СА 125. По време на менструацията нивото на маркер при жените може да се увеличи до 100 kU / l и по-високо. Нивото на СА 125 нараства при почти 80% от пациентите с епителни тумори на яйчниците, но само половината от пациентите с I етап на рак на яйчниците според международната (FIGO) класификация на това заболяване показват висок процент на туморен маркер. Недостатъчната чувствителност при ранната диагностика, както и откриването на повишени стойности на СА 125 при различни доброкачествени тумори и други аденокарциноми, не позволяват използването на този индикатор като маркер за ранно откриване на рак на яйчниците. Наред с нивото на други маркери (α-OP, hCG, hCGb), нивото на СА 125 може да се повиши с тумори от клетките на зародишните клетки.

Прогнозата за рак на яйчниците зависи основно от стадия на заболяването. Скринингът на СА 125 е нечувствителен и само 50% от пациентите с I стадий на заболяването имат повишено ниво на маркер, поради което този маркер не се препоръчва за откриване на спорадични случаи на заболяването. Въпреки това, определянето на СА 125 в комбинация с ръчно ректовагинално изследване на тазовите органи и трансвагиналната ултрасонография може да бъде важно при ранното откриване на рак на яйчниците.

Многоцентрово, проспективно проучване на жени в постменопауза с тумори в малкия таз и сравнение на трансвагинална ултрасонография, ръчно изследване на тазовите органи и определяне на СА 125 (праг на КА 125 35 kU / l) показва, че диагнозата е потвърдена от тези методи съответно 77, 76 и 74%, В допълнение, използвайки регресионен анализ, беше показано, че в сравнение с ултрасонографията СА 125 е по-чувствителен, но диагностичната стойност е по-ниска от тази на ръчното изследване. Туморите не се откриват с комбинация от отрицателните резултати от трите метода. Определянето на нивото на СА 125 преди операцията може да накара лекаря да получи възможна хирургическа помощ.

Известно е, че традиционните прогностични фактори при пациенти с рак на яйчниците са стадия на заболяването, степента на диференциация и хистологичния тип на тумора, размерът на остатъчния тумор след палиативна циторедуктивна хирургия. В същото време, мултицентровите проучвания показват, че нивото на СА 125 в серума на пациентите след 1-ва, 2-ри и 3-ти курс на химиотерапия е един от най-важните прогностични фактори за ранна възраст.

негов рецидив на болестта. Удълженият полуживот на КА от 125 или по-малко от 7-кратно намаляване на нивата на туморен маркер в първите месеци след лечението показва лош резултат. Допълнителни проучвания показват, че концентрацията на СА 125> 70 kU / l преди третия курс на химиотерапия е най-важният фактор за прогнозиране на прогресията на заболяването през следващите 12 месеца.

CA 125 при наблюдение на пациенти с рак на яйчниците позволява да се открие ранна рецидив. В литературата обаче няма данни, които да сочат, че навременното откриване на рецидив на заболяването може да подобри степента на преживяемост. Увеличението на СА 125 показва остатъчно заболяване в 94,8% от случаите, но почти половината от пациентите с нормални маркерни стойности също имат заболяване (туморни възли) според “втората визия” -лапаротомия. Нивата на СА 125 се повишават в серума на 25% от пациентите, които имат само микроскопски признаци на заболяването и при 79% от пациентите, чийто диаметър на рецидивиращ тумор е повече от 1 cm по време на лапаротомията.

Рак на гърдата

Ракът на гърдата е една от основните причини за смъртта на жените в западноевропейските страни и по време на живота на жената рискът от този тумор е 12,2%, а рискът от неговото смърт е 3,6%. Има много фактори, които са свързани с риска от рак на гърдата: генетични и семейни фактори, хормонални фактори, диета, доброкачествени заболявания на гърдата (предимно свързани с атипична хиперплазия).

Понастоящем са известни редица туморни маркери за рак на гърдата: MIS-1 (СА 15-3), СЕА, онкопротеини, цитокератини. Най-широко използвани са СЕА и СА 15-3. Има и други членове на генното семейство MIS-1: MSA, СА 519, BR27-29, BRMA. Всички те имат еднаква чувствителност и специфичност, както и SA 15-3. Следователно, използването на няколко маркера не добавя непосредствено към информацията, получена чрез CA 15-3. Редица маркери, като цитокератини (TPA, TPS, CYFRA 21-1) и разтворими онкопротеини (c-erbB-2), в момента се изследват интензивно и се подлагат на клинична оценка.

Чувствителността на туморни маркери при пациенти с ранен рак на гърдата е много ниска (15-35%), така че тяхната употреба в диагнозата

често е трудно. Разбира се, получените ниски маркерни стойности не изключват наличието на първични и метастатични огнища. От друга страна, високите нива на маркер при пациенти с рак на гърдата почти напълно показват наличието на туморна генерализация и индивидуални метастази.

Високите нива на СЕА, СА 15-3 и други маркери на семейството MIS-1 са ясно свързани с етапа на рак на гърдата, размера на тумора и участието на регионалните лимфни възли в туморния процес. Но все още не е ясно дали тези маркери са независими прогностични фактори. Освен това, не е известно дали използването на такъв туморен маркер като индикатор за ранна рецидив на заболяването ще доведе до увеличаване на преживяемостта без рецидив и цялостна преживяемост на пациентите.

В случай на радикално лечение на рак на гърдата, серийни определяния на СЕА и СА 15-3 също могат да бъдат показани в ранната диагностика на рецидив. Тези туморни маркери в рамките на 2-18 месеца (средно 5.2 месеца) се откриват при 40-60% от пациентите с рецидивиращ рак на гърдата преди положителна реакция според резултатите от клинични, инструментални и рентгенологични методи (рентгенография на гръдния кош, ехография на черния дроб, скелетно сканиране). Динамичното определяне на нивата на СЕА и СА 15-3 се смята за доста чувствителен тест в ранната диагностика на костни и чернодробни метастази и освен това намалява честотата на пациентите с изотопно сканиране и радиоизотопни диагностични процедури.

Тъканни маркери при рак на гърдата

За разлика от класическите туморни маркери, определени в серума, клетъчните или тъканните маркери се изписват директно в туморната тъкан. Повечето от тях характеризират някои биологични особености на тумора, спецификата на неговото поведение и регулация, например, хормонална чувствителност или склонност към инвазия и метастази. За някои молекулярни маркери специфична биологична функция все още не е установена. Основното значение на тези маркери се състои в това, че те характеризират биологичните особености на всеки конкретен тумор и спомагат за прогнозиране и индивидуализиране на лекарственото лечение на заболяването.

В раздела. 4.10 представят биологично значими показатели, които са активни или потенциални тъканни маркери на рак на гърдата.

Таблица 4.10. Основните групи тъканни / клетъчни прогностични маркери за рак на гърдата

В общия случай, дефиницията на молекулен маркер при рак на гърдата може да има три практически резултати: 1) идентифициране сред пациентите с ранни стадии на ракови рискови групи, изискващи допълнително лечение, както и тези, които не са обект на адювантна терапия; 2) определяне на чувствителността към определени видове терапия и индивидуализиране на схемите за адювантно лечение на пациенти с общ процес; 3) разработване на нови лекарства.

Стероидните хормонни рецептори, предимно естрогенни рецептори (ER), бяха сред първите показатели, включени в практиката за лечение на показатели за рак на гърдата, свързани с категорията на клетъчните маркери. По-късно, в допълнение към тях, бяха идентифицирани и рецептори на прогестероновия рецептор (RP).

Наличието на ER в първичния тумор на гърдата показва потенциалната му чувствителност към терапевтични мерки, насочени към отстраняване на източника на естрогени от организма или за противодействие на техните ефекти (овариектомия, употреба на антиестрогени).

RP представлява интерес като молекулен маркер за рак на гърдата, не само защото е първият елемент на клетъчния отговор на прогестини, определящ чувствителността към съответните лекарства, но и защото неговият синтез в клетките на рака на гърдата се индуцира от естрогени. Следователно, присъствието на RP може да показва функционалната активност на ER.

В момента различни клиники и лаборатории използват три сравнително еквивалентни методи за определяне на рецепторния статус на рак на гърдата: радиолиганд - оценка на рецепторната свързваща способност в цитозола на туморите; ензимен имуноанализ - определяне на концентрацията на имунореактивен рецепторен протеин в същите цитозоли; имунохистохимично-специфично оцветяване на туморни секции, използвайки антитела към рецепторни протеини. Предимството на първите два метода е количествено, което позволява да се обосноват критериите за оценка на рецепторния статус. Радиолигандният метод също така дава възможност да се оцени функционалната активност на рецептора в един от първите етапи на неговото взаимодействие с хормона, което прави прогнозата на чувствителността на хормоните по-надеждна, отколкото при определяне на имунореактивни протеини.

От друга страна, макар имунохистохимичният метод да е полуколичествен по своята същност, той има важна заслуга, а именно, че когато оцветявате секциите, можете ясно

за определяне на принадлежността на рецепторите към туморните клетки. При използване на биохимични методи тази възможност липсва. В допълнение, този метод ви позволява да работите с архивни материали - парафинови блокове и дори готови стъкла, което го прави единственият възможен вариант, когато се появи необходимостта от изследване на рецептори на стероидни хормони или се реализира дълго време след операцията.

Известно е, че хормон-зависимият вариант на рак на гърдата, когато и двата, или поне един от стероидните хормон рецептори е типизиран, се характеризира с благоприятен ход и следоперативният период при тези пациенти е по-добър, отколкото в случая на рецептор-отрицателни тумори. Въпреки това, в практическата клинична работа, резултатите от определянето на рецепторите на стероидните хормони се използват главно при подбора на пациенти, чувствителни към ендокринната терапия.

Рецептори на растежен фактор. Тази група включва и самите растежни фактори - протеини и малки полипептиди, произведени от самите туморни клетки и други компоненти на туморната тъкан (фибробласти, макрофаги и лимфоцити, инфилтриращи тумора, ендотелни клетки) и стимулиращи растежа на производствените клетки (автокринен механизъм) или съседни клетки (паракринни) механизъм).

Различни фактори на растежа участват в автокринната и паракринната регулация на пролиферацията на раковите клетки на гърдата: пептиди от групата EGF (α-трансформиращ растежен фактор, амфирегулин и др.), Които взаимодействат с общия рецептор, инсулиноподобните растежни фактори (IGF), соматостатина и др. при тумори при пациенти с рак на гърдата. Наличието в тумора на млечната жлеза на EGFR, особено в отсъствието на стероидни хормонни рецептори, показва неблагоприятна прогноза на заболяването дори в ранните стадии и резистентност към ендокринната терапия. Има доказателства, че наличието на рецептори на IGF и рецептори на соматостатин показва по-благоприятна прогноза за рак на гърдата.

Въпреки това, поради неяснотата на резултатите, получени от различни автори, нито един от показателите, характеризиращи чувствителността на рака на гърдата към авто- и паракринни регулатори, все още не е влязъл в рутинната клинична практика, като изследването на нивото на рецепторите на стероидни хормони. Може обаче да се очаква, че в близко бъдеще интересът към изследването на EGFR при рак на гърдата ще се увеличи отново, поради факта, че вече на етапа на клиничното лечение

изпитания, лекарства, специфично действащи върху EGFR, моноклонални антитела към рецептора и инхибитори на вътрешната тирозин киназа EGFR, реализиращи първия етап на предаването на митогенен сигнал, са освободени.

Трябва да се отбележи, че досега "златният стандарт" в изследването на рентгеновата дифракция се счита за определяне на радиолиганд в мембранната фракция на тъканите, използвайки 125 I-белязан EGF и последващото отделяне на хидроксил-апатит.

Някои успехи в областта на практическото използване на маркери, свързани с REFR-зависимата регулация на растежа на рака на гърдата, вече са постигнати след появата на лекарството Herceptin, което е хуманизирано антитяло към HER2 / neu, един от рецепторите на семейството ErbB, към което принадлежи REFR.

Семейство рецептори на тирозин киназа - продукти на онкогените от групата c-erbB, която включва четири трансмембранни рецептора с подобна структура, REFR (ErbB-1), ErbB-2 (HER2 / neu), ErbB-3 (HER3) и ErbB-4 (HER4) ) е една от най-важните регулаторни системи за предаване на митогенен сигнал.

В допълнение към структурата, ErbB семейството на рецепторите се различават по относителна специфичност и афинитет за различни общи лиганди. Основната характеристика на всички рецепторни тирозин кинази е трансмембранната локализация и необходимостта от взаимодействие със съответния лиганд (активиращ фактор) за осъществяване на киназна активност и последващи биологични ефекти. След активиране в резултат на свързване на лиганда и димеризация, вътрешната рецепторна тирозин киназа се активира и придобива способността да фосфорилира както самия рецептор, така и други клетъчни протеини, участващи в предаването на митогенния сигнал. Рецепторите на семейството ErbB могат да образуват както хомо-, така и хетеродимери, и в много случаи хетероструктурите с участието на HER2 / neu рецептора, който няма свой собствен лиганд, са най-активни.

По този начин, HER2 / neu е уникален представител на разглежданото семейство от трансмембранни тирозин кинази, тъй като, без да има свой собствен лиганд и не взаимодейства с някой от известните растежни фактори, които активират свързани рецептори, той все пак е ключов елемент в предаването на митогенни сигнали от всички EGF- подобни пептиди и е необходим за успешното функциониране на цялата система.

Що се отнася до прогностичната стойност на свръхекспресията или амплификацията на c-erbB-2 гена, въпреки гигантския материал (повече от 12 000 пациенти с рак на гърдата вече са изследвани в различни лаборатории по света), няма консенсус за прогнозната стойност на HER2 / neu. Някои автори отбелязват неблагоприятното му въздействие върху преживяемостта без рецидиви при пациенти с рак на гърдата без метастази в лимфните възли, други изследователи не намират надеждна връзка между тези показатели. Публикуваните данни показват, че туморите с усилен HER2 / neu ген не реагират добре на хормоналната терапия, но са чувствителни към последваща химиотерапия. В момента се счита също така, че пациентите с HER2 / neu-позитивни тумори трябва да се препоръчват по-интензивни схеми на химиотерапия, отколкото пациентите с тумори, които нямат повишена експресия на този онкоген.

Система за активиране на плазминоген. Способността за метастазиране и инвазия е едно от основните свойства на злокачествените тумори, най-важният механизъм на който е разрушаването на заобикалящата мембрана и екстрацелуларния матрикс от тумор-асоциираните протеази. Тези протеази също участват в неоангиогенезата, допринасяйки за пролиферацията на нови кръвоносни съдове в тумора.

Протеолитичната каскада на активиране на плазмин в туморната тъкан заема централно място. Счита се, че плазминът, който е в състояние да намали нивото на екстрацелуларните матрични гликопротеини и да активира някои прометални протеази, като колагеназа тип IV, играе решаваща роля както за локалното разпространение на тумора, така и за образуването на метастази в отдалечени органи и тъкани. В многостепенна верига от протеази, водеща до разрушаване на извънклетъчния матрикс, урокиназният тип плазминогенен активатор (uPA) заема ключова позиция. UPA рецепторът, разположен върху клетъчната повърхност също играе важна роля, тъй като способността на uPA да активира плазминогена се увеличава, когато се свързва с него. Като цяло, процесът на образуване на плазмин е циклично усилване, регулирано от механизъм за обратна връзка.

В допълнение към uPA, активатор на тъканния тип (tPA) също участва в активацията на плазминоген, но ролята му в развитието на тумори изглежда противоположна и намалява до разрушаване на туморни клетки.

клетките и защитата на околните тъкани. IRA и tPA активността се инхибира от два протеинови инхибитора, принадлежащи към семейството serpin, PAI-1 и PAI-2. Въз основа на експериментални и клинични данни, по време на растежа на тумора, две инхибитори на плазминогенни активатори също играят различна роля: PAI-1 предпазва туморните клетки от самоунищожение, а PAI-2 инхибира протеолитичните процеси в извънклетъчния матрикс.

Различните компоненти на плазминогенната активационна система в тъканта на гърдата могат да бъдат разположени както върху самите туморни клетки, така и върху строма фибробластите, лимфоцитите и макрофагите и ендотелните клетки, инфилтриращи тумора. В тази връзка можем да приемем, че процесът на активиране на плазминогена е предимно паракрин.

Нивото и съотношението на експресията на компонентите на плазминогенната активационна система в туморната тъкан могат да служат като индикатор за метастатична и инвазивна туморна активност, в резултат на което биологично значим прогностичен фактор за злокачествени тумори или индикатор за риска от злокачествено заболяване при доброкачествени новообразувания. В допълнение, потискането на активирането на плазминогена от типа на урокиназата на различни нива може да се превърне в един от подходите за разработване на нови типове антиметастатична терапия, за които е необходимо клинично използване, за да се идентифицират групи пациенти, потенциално чувствителни към такова лечение. Разработването на такива лекарства вече е доста активно в експериментални лаборатории и фармацевтични компании, което прави изследването на техните целеви протеини в човешките тумори особено уместно.

Най-адекватният метод за оценка на нивото на експресия на компонентите на плазминогенната активационна система понастоящем се счита за количествен ензимен имуноанализ за определяне на тяхната концентрация в цитозолите на тъканите. За съжаление все още не са установени единни прагове, въпреки че в тази насока вече се провеждат международни съвместни изследвания.

Съдов ендотелен растежен фактор. През последните години се обръща голямо внимание на проблема с неоангиогенезата - образуването на нови кръвоносни съдове - при злокачествени тумори. За разлика от васкулогенезата, ангиогенезата е процес на разклоняване на нови капилярни процеси от съществуващи кръвоносни съдове. Фактът, че туморът не може да се развие и да расте без образуването на

има широка мрежа от капиляри, които осигуряват на клетките кислород и хранителни вещества. Изследването на молекулярните механизми на ангиогенезата направи възможно преминаването от микроскопска оценка на плътността на кръвоносните съдове в туморната тъкан към изследването на специфични молекули, участващи в регулирането на образуването и растежа на нови кръвоносни съдове. Най-важният положителен регулатор на ангиогенезата несъмнено е VEGF, наричан също фактор на съдовата пропускливост. Уникалността на този фактор се крие във факта, че за разлика от всички други растежни фактори, той е митогенен само по отношение на ендотелните клетки. Доказано е, че VEGF играе ключова роля в неоангиогенезата при рак на гърдата.

Резултатите от редица ретроспективни клинични проучвания, публикувани наскоро, показват, че експресията на VEGF при рак на гърдата изглежда е от съществено значение за прогнозата на заболяването и също така влияе върху чувствителността на туморите към хормонално и лекарствено лечение. Еро високото ниво показва лоша прогноза за ранен и рак на гърдата. В допълнение, активно се разработват и изследват нови лекарства с антиангиогенни свойства и оценката на активността на VEGF-зависимата ангиогенеза може да бъде основа за тяхното целево използване.

Рак на маточната шийка

Почти по целия свят ракът на маточната шийка след рак на гърдата е втората най-честа причина за смърт от туморни заболявания. Основните рискови фактори за това заболяване са социално-икономически, ранни бракове, голям брой сексуални партньори, както и инфекции, причинени от човешкия папиломен вирус (HPV) (типове 16, 18, 31 и 45). Показатели за 5-годишно оцеляване при това заболяване са около 70%. Въпреки това, ако неоплазма се открие на ранен етап, 5-годишната преживяемост се увеличава до 90%. Трябва да се отбележи, че 90% от цервикалните тумори са плоскоклетъчен карцином, а при други хистологични - аденокарцином и плоскоклетъчен карцином. Много рядко се откриват саркоми или невроендокринни ракове.

При диагностицирането на плоскоклетъчен карцином на шийката на матката се използва като туморен маркер SCCA антиген - протеин (молекулно тегло 48 kD) със силна хомология на семейството протеазни инхибитори, т.нар. Чувствителността на метода на етап I на заболяването е по-малка от 30%, а на етап IV - 90%. обаче

Експресията на SCCA може да се увеличи и при други плоскоклетъчни тумори (рак на белия дроб, тумори на главата и врата, рак на хранопровода и вагината), доброкачествени тумори на кожата (псориазис, екзема), бели дробове (саркоидоза), черния дроб и бъбреците. Този туморен маркер не се използва при скрининг.

За скрининг за рак на маточната шийка са предложени в световен мащаб Papanicolau програма, инструментални и морфологични диагностични методи, които диагностицират преинвазивни тумори, такива като in situ карцином (CIS) и интраепителна неоплазия на шийката на матката (CIN). Развитието на тези процеси в рамките на 10-15 години може да предшества рак на маточната шийка. При диагностицирането на ранните етапи SCCA не се използва, тъй като нивото на туморния маркер зависи от обема на първичния тумор, етапа и участието на лимфните възли в туморния процес. Повишените нива на SSCA преди лечението могат да бъдат независим фактор при оценката на метастатичното увреждане на регионалните лимфни възли.

Високите стойности на маркера преди лечението показват лоша прогноза при пациенти с плоскоклетъчен карцином на шийката на матката. Някои проучвания показват, че SCCA може да се използва като независим прогностичен фактор при рак на маточната шийка. При цервикалните аденокарциноми СА 125 е по-полезен като прогностичен фактор, но не и SCCA.

Маркерът SCCA е определен за откриване на ранна рецидив на плоскоклетъчен карцином на шийката на матката, както и за наблюдение преди неоадювантна терапия и преди рецидив на туморна терапия. В тези случаи корелацията е 80%, което е от съществено клинично значение при подбора на пациенти за последваща лъчетерапия или хирургично лечение.

Ракът на ендометриума представлява 50% от всички злокачествени тумори на урогениталния тракт при жените, а в 80% от случаите се открива при изследване на матката. Преживяемостта на етап I е 80%, при IV - 10%. В 60-80% от случаите, туморите имат аденокарциномна структура.

Най-често, рак на ендометриума увеличава туморния маркер СА 125: в стадия на заболяването до 22%, а в етап III-IV - до 80%, нивото на маркер е над 35 kU / l. Няма туморен маркер за скрининг за ранно откриване на рак на ендометриума. Морфологичните изследвания се считат за традиционен метод.

диагностика на рак на ендометриума и тъканни проби, получени след кюретаж на лигавицата на матката.

При мониторирането на рак на ендометриума, СА 125 се счита за най-добрия маркер, като при 60% от пациентите с ранен рецидив на тумора е установено, че увеличението на серума е СА 125.

4.4.5. РАК НА ПЛАСТИНА

В икономически развитите страни мъжката популация от злокачествени новообразувания на рак на белия дроб е 21% в структурата на общата смъртност. Ракът на белия дроб е прототип на тумор, индуциран от химични канцерогени. Установена е тясна връзка между развитието на рак на белия дроб и пушенето на цигари, но не всички пушачи развиват рак, но само 5-10%, което показва важната роля на генетичната предразположеност при тези пациенти. В почти 50% от случаите хирургичното лечение може да се препоръча по време на първоначалната диагноза, но само в 70% от тях туморът се резекцира.

Основните хистологични типове рак на белия дроб са: плоскоклетъчна клетка (PRL), аденокарцином, голям клетъчен карцином и дребноклетъчен рак на белия дроб (MRL). Трябва да се отбележи, че МДГОВ се различава от другите хистологични типове тумори на белите дробове по характерните особености на клиничното му развитие. Следователно, всички злокачествени тумори на белия дроб са разделени на SCLC и недребноклетъчен рак на белия дроб (NSCLC), които са част от хетерогенна група тумори.

При рак на белия дроб най-често се изследват следните маркери: неврон-специфична енолаза (HCE), СЕА, 19 цитокератинов фрагмент (CYFRA 21-1), сквамозен раков антиген (SCC), СА 125, тъкан полипептиден антиген (TPA).

Невронспецифичната енолаза за първи път е открита в мозъчните неврони и периферната нервна система. HSE е изоензим на цитоплазмения гликолитичен ензим енолаза (2-фосфо-D-глицератна хидролаза, EC 4.2.1.11) и се състои от две почти идентични γ-тип полипептидни вериги, молекулното тегло на всеки е равно на 39,000 D. В мозъка, заедно с изоформата - димер от а-тип подединици и хибриден изоензим αγ, които имат подобен афинитет към субстрата - 2-фосфоглицерова киселина. Енолаза, съдържаща тази у-субединица (а-у и у-у), се нарича HCE. Изоформите могат да бъдат синтезирани от глиални мозъчни клетки, както и от повечето соматични клетки.

тъкани. Самият ензим се синтезира в централни и периферни неврони и злокачествени тумори с невроектодермален произход (SCR, невробластоми, чревни карциноиди).

Показано е, че горната граница на HSE при здрави хора е 12,5 ng / ml. Като се има предвид обаче, че концентрациите са до 20 ng / ml

и повече, и могат да възникнат при доброкачествени белодробни заболявания, за клинична диагноза, по-високо ниво на праговата маркерна стойност (> 25 ng / ml) е за предпочитане. Увеличение на активността на HCE в серума се открива в 40-70% от първичната

пациенти с IRL и при 83-98% от пациентите с общ стадий на заболяването.

Според данните, предоставени от Центъра за рак на Memorial Sloan Kettering (САЩ), честотата на повишаване на активността на HCE в серума на пациенти със SCR зависи от разпространението на туморния процес: при I-II стадий чувствителността на теста е 39%, на етап III-IV - 87%. Трябва да се отбележи, че при анализа с диагностична значимост много автори определят сравнително висока специфичност в сравнение с други маркери. По този начин активността в емфизема се увеличава само в изключителни случаи, за разлика от която концентрацията на СЕА се увеличава в 7-36% от наблюденията. Резултатите от изследванията показват, че HCE е напълно приложим като избор на туморен маркер, както в диференциалната диагноза, така и при мониторинга на ефективността на терапията за MRL.

В същото време е установено повишаване на активността на HCE в серума на пациенти с туберкулоза (27.3%), както и при пациенти, заразени с HIV вируса, в сравнение с неинфектираните. Пациенти с алвеоларни инфилтрати или интерстициални огнища в белите дробове също са имали значително повишени нива на HCE в серума. Смята се, че увеличаването на серумния HSE при пациенти с доброкачествени белодробни заболявания е свързано с локална хипоксия. Представените резултати трябва да се вземат предвид при анализа на ХСЕ при пациенти с рак на белия дроб и при обструктивни белодробни процеси.

Трябва да се отбележи, че предвид значителната хетерогенност на рака на белия дроб, по-специално на малкия клетъчен вариант, е възможно да се отбележи значимото диагностично и прогностично значение на HCE в сравнение с други туморни маркери.

Рак-ембрионалният антиген, представен от гликопротеин с молекулна маса от около 180 kD, също принадлежи към групата

онкофетални антигени, синтезирани и секретирани от чревните клетки на ембриона и плода, както и някои злокачествени тумори (рак на гърдата, стомаха, рак на белия дроб). За първи път при пациенти с рак на дебелото черво е установена СЕА. Понастоящем, СЕА-подобни съединения са открити и върху клетъчни мембрани в не-ембрионални и неракови тъкани. Има всички основания да се смята, че черният дроб е основният метаболитен сайт на СЕА. Нивото на СЕА в кръвния серум се увеличава при 40-80% от пациентите с злокачествени новообразувания с ендодермен произход, при 20-30% с други форми на рак и при 10-20% с доброкачествени тумори. Най-високата чувствителност на СЕА и най-високите концентрации на маркера са открити в аденокарцинома и големия клетъчен рак на белия дроб.

Антигенът на серумния сквамозен карцином е протеин с молекулна маса от 48 kDa, който е подобен на serpins (протеазни инхибитори). Маркерът се използва за диагностициране на плоскоклетъчен карцином в различни органи (рак на шийката на матката, хранопровода, белия дроб, туморите на главата и шията). Повече от 70% от пациентите с PRL имат повишени нива. Въпреки това, само в 26,1% от нивото на туморния маркер се увеличава в серума с аденокарцином на белия дроб и не се открива с SCR. При 87,8% от пациентите с ранен рецидив на PRL е отбелязано високо ниво на серумен SCC. Идентифицирането на изразяването на SCC в имунохистохимичното изследване на белодробните тумори е от голямо практическо значение.

Тъканният полипептиден антиген е полидисперсна смес от цитокератини 8, 18 и 19 (молекулно тегло от 20 до 45 kD), която може да се полимеризира в разтвор за образуване на олигомери. Активността на TPA зависи от аминокиселинната последователност и позицията на аргининовия остатък. Обикновено се среща във високи концентрации в плацентата и феталните тъкани. ТРА се локализира върху плазмената мембрана и ендоплазмения ретикулум на туморните клетки, произвежда се чрез пролифериращи клетки и се освобождава спонтанно в околната среда. TPA се открива в почти всички злокачествени тумори.

Фрагмент на цитокератин 19. Значението на цитокератин за диференциацията на физиологична и патологична тъкан отдавна е известно в хистопатологията. Цитокератините са неразтворими клетъчни протеини, повече от 20 от тях са добре характеризирани с моноклонални антитела. За разлика от това

от цялата молекула, фрагменти от цитокератин са разтворими в серум. В теста за туморен маркер CYFRA 21-1 се използват два типа моноклонални антитела (Ks 19.1 и BM 19.21) за откриване на фрагмент от цитокератин 19 с молекулна маса 30 kD. Горната граница на нормата при здрави хора е 2,3 ng / ml. Тестът CYFRA 21-1 има добра специфичност за доброкачествени белодробни заболявания, праговото ниво е 3.3 ng / ml. Маркерът има висока чувствителност при диагностицирането на NSCLC.

Няма връзка с CYFRA 21-1 с тютюнопушене. Показано е, че нивото на CYFRA 21-1 е същото в серума на пациенти с незлокачествени белодробни заболявания, SCLC и в контролната група. В същото време са наблюдавани значително по-високи нива на CYFRA 21-1 при пациенти с NSCLC, аденокарцином и PRL. Представените данни потвърждават високата чувствителност и специфичност на CYFRA 21-1 в диференциалната диагноза между злокачествени и незлокачествени белодробни заболявания, както и между МДГ и НДКРБ. Пациентите с метастази в лимфните възли N2 и N3 имат най-високо ниво на CYFRA 21-1 в серум (5,6 ng / ml) (граници на флуктуация 3,2-11,5 ng / ml) в сравнение с пациентите с N0 и N1. (3.9-10 ng / ml) (U-тест на Mann-Whitney; р = 0.0373).

При всички видове рак на белия дроб, CYFRA 21-1 има най-висока чувствителност (57,7%) в сравнение с CEA (45,3%) и SCC (22,6%). Въпреки че комбинацията от CYFRA 21-1 и CEA за диагностициране на NSCLC, чувствителността и точността са увеличени съответно до 75,4 и 78,1%, но специфичността намалява до 86,5%.

Японските изследователи (University of Tsukuba) предлагат да се използва определянето на нивото на CYFRA 21-1 в плевралната течност в допълнение към цитологичното изследване, за да се подобри диагнозата и диференциалната диагноза на рака на белия дроб. Това се дължи на факта, че е установено значително увеличение на маркер в плевралната течност при пациенти с рак на белия дроб (средно 84.5 ng / ml) в сравнение с пациенти с доброкачествени тумори (13.9 ng / ml). В допълнение, нивото на CYFRA 21-1 в плевралната течност на пациенти с PRL е значително различно от това при пневмония, докато CEA не разкрива такива разлики.

При определянето на CYFRA 21-1 трябва да се знае възможното повишаване на нивото до 10 ng / ml при прогресиращи доброкачествени чернодробни заболявания и особено при бъбречна недостатъчност. Замърсяването на пробата с елементи на слюнка също може да бъде

да доведе до значително увеличение на стойността на CYFRA 21-1. В този случай резултатът не засяга пола, възрастта, тютюнопушенето и бременността. Проучванията на всички видове твърди тумори показват, че CYFRA 21-1 е ефективен маркер за NSCLC и PRL.

В заключение нека разгледаме някои особености на употребата в клиниката на маркери на злокачествен растеж на примера на рак на белия дроб.

Преди всичко, не трябва да използвате всички горепосочени маркери за скрининг за асимптоматичен рак на белия дроб или при пациенти с висок риск от развитие на този вид тумор. Първичната диагностика и първичното лечение на пациенти с рак на белия дроб се основават на клинични и инструментални методи на изследване (клинични, ендоскопски, рентгенови, интраоперативни находки).

Освен това, NSE маркерът трябва да се счита за изключително важен в имунохистохимичната диагноза на туморен вариант. Често само определянето на HCE в серума помага да се потвърди диагнозата на SCLC.

Серумната концентрация на SCC> 2 mg / l показва 95% вероятност за откриване на NSCLC и 80% от плоскоклетъчен рак на белия дроб.

При СА 125 нива над 100 U / ml и СЕА над 10 mg / l, трябва да се предложат аденокарцином или голям клетъчен рак на белия дроб.

Накрая, въпреки че често серумната концентрация CYFRA 21-1, TPA, HCE, CEA показва наличието на тумор, не се наблюдава

силна връзка между производството на туморни маркери и хистологичния вариант на белодробен тумор. В повечето случаи високото ниво в този случай показва разпространението на туморния процес и следователно прогнозата трябва да бъде разочароваща. Въпреки това ниските и средни стойности на тези маркери никога не позволяват напълно да се елиминира всеки вариант на тумора или прогресията на заболяването.

Въпреки всички горепосочени ограничения, туморните маркери в първичната диагноза на рак на белия дроб могат да бъдат важни в следните ситуации.

Първо, тумор-асоциираните антигени, изразени по време на първоначалната диагноза, трябва да се използват при мониториране на даден пациент. CYFRA 21-1, REA и СА 125 са силно значими прогностични фактори при NSCLC и HCE в MRL.

Второ, намаляване на нивото на туморни маркери в следоперативния период (

2-3 дни за CEA, 1 ден за NSE, няколко часа

за CYFRA 21-1) дава на лекаря полезна информация за радикалния характер на извършената операция и за ефективността на терапията и следователно за добра прогноза. От друга страна, бавното намаляване на нивото на маркер в кръвния серум показва недикалността на извършената операция и предполага наличието на остатъчни огнища на тумора.

Трето, постепенното увеличаване на туморния маркер може да бъде първият признак за рецидив на заболяването. Такова увеличение може да се установи 12 месеца преди клиничните признаци на рецидив. За рак на белия дроб, HCE може да служи като критерий за диференциалната диагноза на различни хистологични типове тумор, особено в случаите, когато не е възможно да се извърши биопсия и да се потвърди видът на тумора с морфологични данни.

4.5. МОЛЕКУЛЯРНА ГЕНЕТИЧНА ДИАГНОСТИКА

Основната задача на съвременната молекулярно-генетична диагностика (МДХ, ДНК-диагностика) е откриването на наследствени аномалии за последващо използване при диагностика, прогнозиране и избор на стратегия за лечение на много заболявания. В същото време, МХД се счита за много по-широк, отколкото просто да се анализира последователността на човешката геномна ДНК, тъй като почти винаги допълнителна информация за наследственото заболяване може да бъде получена и чрез анализ на състоянието на самите хромозоми и РНК и протеини и метаболити.

Подобно на други методи на клиничната биохимия, генетичното изследване се използва за диференциална диагностика на заболявания. При редица заболявания, например при наследствени форми на рак или "метаболитни грешки", откриването на мутации става диагностичен критерий, толкова важен, колкото клиничните симптоми. Но, разбира се, основното предимство на ДНК-диагностиката е способността да се определи податливостта към конкретно заболяване в пресимптомния стадий. В някои случаи това позволява да се предотврати развитието на самото заболяване чрез хирургическа интервенция, лекарствена терапия или промяна на начина на живот на пациента. В допълнение, пренаталното ДНК изследване може да открие наследството на патологични гени и съответно да определи показанията за изкуствено прекъсване на бременността.

Необходимо е да се отбележи такава обещаваща посока на МХД като фармакогенетика. Точното типизиране на генотипа на пациента позволява да се оценят гените, които са пряко свързани с абсорбцията, метаболизма и лекарственото действие, т.е. съществува реална възможност за идентифициране на пациенти, които са особено чувствителни към дадено лекарство, и за избягване на усложнения, дължащи се на непоносимост към това лекарство по време на лечението. В някои случаи генотипирането също ви позволява да изберете най-подходящото лекарство. Вече е безопасно да се каже, че с развитието на фармакогенетиката, лекарствената терапия все повече ще разчита на анализа на генотипа на пациента.

По този начин, използването на МГД в клиничната практика предлага широки възможности не само за диагностициране и оценка на генетичния риск от заболявания, но и за избор на индивидуална лекарствена терапия. Надяваме се, че активното развитие на човешката молекулярна генетика ще постави диагностиката на ДНК на равна нога с такива незаменими инструменти в арсенала на биохимичен лекар, като например методи за определяне на активността на ензимите в кръвта.

4.5.1. ВИДОВЕ ГЕНЕТИЧНА ОБРАБОТКА

В популацията обикновено има няколко варианта (алели) на всеки ген. Ако честотата на такива варианти е доста висока и не може да се обясни с случайна поява на идентични мутации в различни семейства, тогава говорим за полиморфизъм на даден локус.

По-редки варианти на гени се наричат мутации. Каква е границата между полиморфизма и мутациите? Счита се, че полиморфизмът включва варианти на гени, открити в хетерозиготна форма повече, и мутации по-малко от 1% от популацията. Въпреки това, на практика, мутанти често се наричат алели, които предразполагат към определена патология, дори ако тяхната честота в популацията е над 1%. По-долу са изброени видовете мутации, които могат да доведат до патологични промени.

• Миссенсните мутации или нуклеотидните замествания са най-често срещаният вид мутация. Заместването на нуклеотиди в някои позиции на кодон не води до замяна на кодираната аминокиселина; такива мутации се наричат тихи или синоними. Когато кодираните аминокиселини се променят в резултат на миссенсна мутация, функцията на протеина често се променя. Запазването на функцията на протеина се наблюдава, ако

аминокиселината, получена от мутантния кодон, принадлежи към същия структурен клас като нормалната аминокиселина. Единичните нуклеотидни замествания имат най-голям ефект върху протеина, което води до образуването на стоп кодон (безсмислени мутации). Скъсената иРНК и протеинът често са неактивни и бързо се разграждат.

• Изтриване и вмъкване. Такива мутации варират по дължина от един до милион нуклеотиди и съответно се наричат микро- и макро-делеции (инсерции). Разбираемо, макромутациите засягат много големи сегменти на хромозомите (от 10 милиона базови двойки), т.е. става възможно да се открият с цитогенетичен анализ. Микромутациите засягат малко количество нуклеотиди и се използват методи за анализ на нуклеотидната последователност на ДНК, за да бъдат открити. Малките инсерции и делеции не могат да повлияят на функцията на кодирания протеин. Фаталните последствия обикновено се наблюдават, когато броят на вмъкнатите / делеционните нуклеотиди не е кратен на три. Когато това се случи, синтезира се изместване на рамката за четене и безсмислена аминокиселинна последователност. Най-често той се прекъсва много бързо от образуването на нов стоп кодон. Класически пример за ефекта от промяна на рамката върху ефектите на делеция са две свързани заболявания - мускулна дистрофия на Дюшен и Бекер. И двете се причиняват от мутации в гена на дистрофин и 2/3 от тези мутации са при двете заличаващи заболявания. Мускулната дистрофия на Бекер е много по-лека от Дюшен, но тази разлика не е свързана с размера на делециите. Причината за различията е, че в повечето от откритите случаи на миодистрофия на Дюшен делециите водят до промяна в рамката на четене и в резултат на това дистрофинът престава да се формира напълно, докато при миодистрофията на Бекер мутантният дистрофин запазва известна активност.

• В някои случаи мутациите засягат некодиращи участъци от ДНК, които участват в инициирането на транскрипция на даден ген или сплайсинг на иРНК. Такива промени могат също да доведат до нарушаване на структурата, стабилността или нормалната регулация на експресията на този протеин.

• Нестабилни или динамични мутации обикновено се развиват в области, съдържащи множество копия на тринуклеотидни повторения. В резултат на грешки при репликация на ДНК или неравномерно пресичане, броят на такива повторения може да се увеличи или намали, в резултат на което такива мутации се наричат динамични. Ако номерът

повторенията надвишават определена прагова стойност, функцията на даден или близките гени е нарушена. Механизмите за изключване на гени по време на натрупването на тринуклеотидни повторения не са напълно ясни. По-специално, при синдрома на крехка Х хромозома, увеличаването на броя на повторенията на CGG в FRAXA локус над 200 води до метилиране и инактивиране на този ген. Увеличаването на броя на тринуклеотидните повторения също е в основата на болестта на Хънтингтън (над 35 CAG повторения в гена на Хънтингтън) и миотонична дистрофия (над 50 повторения в 3'-нетранслирания регион на DMPK гена, кодиращ протеин киназата). Характерна особеност на тези заболявания е, че в едно семейство тежестта на заболяването може да се увеличи в редица поколения, поради разширяването на нуклеотидните повторения.

Като цяло, появата на мутации води до промяна в функцията или експресията на протеина. Тази промяна се проявява като увеличаване и намаляване, често до пълна загуба, функция или експресия на протеина. В случай на повишаване на функционалността, също е възможно за един протеин да придобие нови функции.

ДВИЖЕНИЕ С ФУНКЦИИ НА ЗАГУБИТЕ

Намаляването на функционалната активност на протеин в тъкан може да бъде резултат от промяна в структурата на протеина и транскрипционната активност на даден ген. Например, намаляване на експресионното ниво на LDL рецептора, дължащо се на мутация в промоторната област, ще доведе до точно същата хиперхолестеролемия, която би се наблюдавала, ако се синтезират нормални количества от функционално дефектен рецептор, които не могат да свързват или интернализират липопротеини.

Промените в протеиновата структура, причинени от аминокиселинни замествания или разрушаване на тРНК обработката в резултат на мутации в местата на сплайсиране, водят до появата на анормални тРНК и протеини, които са подложени на ускорено разграждане, което води до намаляване на общото количество активен протеин. Например, трите най-често срещани дефектни алела на тиопуриновата метилтрансфераза кодират бързо разграждащи се протеини, което води до рязко намаляване на ензимната активност, което е придружено от повишена чувствителност на пациентите към тиопурини. В други случаи, като например а-таласемия, може да се наблюдава делеция на целия ген, което води до пълно отсъствие на продукта.

Механизмите на загуба на действителната функционална активност на протеина могат да бъдат много разнообразни. В резултат на това мутациите могат

заместване на аминокиселини, които играят ключова роля в структурата или каталитичната активност. В резултат на мутации може да се наруши нормалната обработка или протеиновия транспорт. Например, най-честата мутация, причиняваща кистозна фиброза, делеция на фенилаланин в позиция 506 на CFTR гена, не влияе на синтеза или функционалната активност на този протеин, но разрушава неговия вътреклетъчен транспорт, в резултат на което не се включва в плазмената мембрана и следователно губи способността си да функционира като хлорен канал.

Като правило, мутациите със загуба на функция водят до заболявания с рецесивен режим на наследяване. Това се дължи на факта, че за пълното функциониране на метаболитния път обикновено е достатъчно количеството на активния протеин, който се произвежда от един нормален алел. И повечето от тези болести.

По-рядко се срещат случаи, при които количеството на синтезирания протеин става недостатъчно. В този случай, болестта ще започне да се появява, дори ако има един мутант алел, и наследяването става доминиращо. Малко е известно за такива заболявания, като една от тях е фамилна хиперхолестеролемия, причинена от дефект в гена на LDL рецептора. Това заболяване се характеризира и с ефекта на генна доза, която се проявява във факта, че фамилната хиперхолестеролемия е много по-тежка при хомозиготи в сравнение с хетерозиготите.

Доминиращият тип наследяване се проявява, когато мутантният протеин не само губи своята активност, но и пречи на функционирането на продукта на нормалния алел в хетерозиготите. Тази ситуация е включена в литературата, наречена доминантно-отрицателен ефект. Този ефект се открива в случая на мултимерни протеини, които по-специално включват колагени или димерни транскрипционни фактори.

Мутации с придобиване на функции

Сред широката гама от функции за повишаване на мутацията, най-интересно от гледна точка на клиничната биохимия са случаите, когато протеинът придобива нова функция. Новополучената функция може да се появи на нива като взаимодействието на ензима с нов субстрат, необратимо активиране на предаващия сигнала протеин или йонния канал, нарушаване на нормалния процес на инактивиране на ензима, анормална олигомеризация на протеина или синтез на химерен протеин.

Миссенсът на Ала е добър пример за придобиване на функция.₃₆₆-Сив в ген GNAS1, кодиращ а-субединицата на хетеротримерния GTP-свързващ протеин Gs. Този протеин свързва 7-доменни трансмембранни хормонални рецептори с аденилат циклаза. Мутацията води до двойна промяна в протеиновите свойства. Първо, освобождаването на БВП се ускорява и съответно се увеличава фракцията на GTP-свързания (активен) ασ протеин, което води до конститутивно активиране на аденилат циклаза. Второ, протеинът става термолабилен при 37 ° С. В тази връзка, във всички органи, с изключение на тестиса, активността на Gs намалява, което води до развитие на наследствена остеодистрофия Albright. А в тестиса, където температурата е по-ниска, протеинът Gs се активира необратимо, което води до тестоксикоза.

Най-честата причина за придобиването на функция е повишената експресия на гена или нарушаването на мястото или времето на неговата експресия, което е най-характерно за злокачествено трансформирани клетки.

За мутации с придобиването на функция, като правило, характерно е доминиращият тип наследяване. В онези редки случаи, когато мутации с придобиване на функция са в хомозиготно състояние, се наблюдават много тежки форми на заболяването, често с пренатална смъртност. Пример за това е хомозиготна ахондроплазия, най-честата причина за джуджето, причинена от мутации в FGFR3 гена, който кодира рецептор за фибробластен растежен фактор. Делециите на мястото на хромозомата, на които се намира FGFR3 при други заболявания, не водят до скелетни аномалии, характерни за ахондроплазия, което предполага повишаване или придобиване на функция при това заболяване. Ахондроплазията винаги се открива в хетерозиготна форма, тъй като хомозиготността за тази черта е смъртоносна.

ПРИНЦИПИ НА ТЪРСЕНЕ НА МУТАЦИИ

Общият подход към търсенето на мутации в човешката геномна ДНК се основава на редица принципи.

Използването на един или друг метод в ДНК диагностиката зависи от наличието на информация за възможния вид мутация при даден пациент. В случаите, когато видът на мутацията е неизвестен, се използват скринингови методи за откриване на всякакви разлики в нуклеотидната последователност на мутантните и нормалните гени. Ако мутацията е известна, например, тя вече е била идентифицирана при роднини, за изследването се използват други, по-прости.

и в същото време по-ефективни методи, които могат да бъдат наречени методи за откриване на известни мутации.

Освен това, независимо от насочеността (скрининг или откриване) на избрания метод, е необходимо да се вземе предвид, че една група от методи се основава на специфичността на нуклеотидното сдвояване при образуването на двойна верига на ДНК, а другата върху разпознаването на ДНК последователността чрез ензими.

За първата група методи, фрагментите от последователността на изследвания ген, съответстващи на дивия тип, който е най-често срещаният в популацията, се използват като референтна последователност. Това може да бъде или кратък олигонуклеотиден праймер (около 20 нуклеотида), или по-дълъг ДНК фрагмент, използван за хибридизация. В случай, че ДНК на пациента съдържа мутация в областта, обхваната от пробата, пълна хибридизация между мутантния алел и пробата е невъзможна. Това води или до отсъствието на продукта от полимеразната верижна реакция (PCR), или до образуването на неадекватен ДНК дуплекс, съдържащ неспарени нуклеотидни региони, които се откриват с различни химични или ензимни методи.

Класически пример за метод, основан на разпознаването на ДНК последователности от ензими, е използването на рестрикционни ензими, ензими, които разцепват ДНК в области, съдържащи строго индивидуални последователности с дължина 4-8 нуклеотида. Появата на отклонения в нуклеотидната последователност в резултат на мутация може или да доведе до загуба на вече съществуващо място на разцепване за всеки рестрикционен ензим, или, обратно, до неговия външен вид. В същата група методи се използват ензими на ДНК полимераза. Тези ензими синтезират комплементарна верига в точно съответствие с последователността на едноверижна матрица. Използвайки белязани нуклеотидни блокове, е възможно да се определи в коя последователност нуклеотидите са разположени в дадена матрица. Този принцип е в основата на ензимното секвениране (определяне на нуклеотидната последователност) съгласно метода на Sanger, както и в неговите опростени версии, предназначени да определят нуклеотидната последователност на късите секции на ДНК (мини-секвениране).

В преобладаващата част от случаите, преди анализът на правилните мутации, изследваният фрагмент от генома на пациента се усилва чрез PCR. Целта на PCR обикновено е просто умножение.

броят на копията на този фрагмент, което улеснява технически последващия ДНК анализ (фиг. 4.3). В по-голямата част от PCR варианти в хетерозиготи, както нормалните, така и мутантните алели се усилват със същата ефективност и тяхната дискриминация се извършва на следващите етапи. Има и алел-специфични

Фиг. 4.3. Схема на полимеразна верижна реакция

PCR, в която се използват праймери, които са хомоложни на нормалния или мутантния алел, което позволява наличието на мутация да бъде определено още в PCR стадия чрез присъствието или отсъствието на амплификационен продукт.

Друг универсален метод, често използван за диагностициране на мутации, е ДНК секвениране. Секвенирането се използва както за търсене на неизвестни мутации, така и за потвърждаване на нарушения, открити чрез други методи. Съществуващите методи позволяват директно секвениране на PCR продуктите, заобикаляйки клонирането на PCR фрагмента в бактериите. Предимството на последователността е гъвкавост и е изключително информативно. Основното ограничение на този метод е високата цена, която не позволява да се използва като основен при търсенето на мутации.

Броят на съществуващите методи за анализ на мутациите е изключително голям и тяхното описание без преувеличение ще изисква отделна книга. По-долу са описани само онези методи, които са по-добре адаптирани за използване в клиничната практика, т.е. отговарят на следните изисквания: достатъчна чувствителност за идентифициране на мутации, добра възпроизводимост, ниска цена и възможност за автоматизация.

МЕТОДИ НА МУТАЦИОНЕН СКРИНИНГ

Методи за мутационен скрининг се използват в случаите, когато природата на мутацията е неизвестна, а клиничната картина на наследственото заболяване предполага, в кои специфични гени може да възникне прегрупиране. Например, наличието на хиперхолестеролемия IIa тип в комбинация с ксантоми на сухожилие показва наличието на фамилна хиперхолестеролемия и предполага, че мутацията трябва да се търси в гените, свързани с улавянето на LDL клетки, главно в гена на LDL рецептора. Тъй като мутациите в този ген с фамилна хиперхолестеролемия са много разнообразни и могат да засегнат цялата дължина на гена, е необходимо да се анализират големи части от ДНК. Секвенирането на такъв дълъг генен фрагмент е твърде скъпо, затова се използват по-прости методи.

АНАЛИЗ НА МАКРО-ВЪЗСТАНОВЯВАЩОТО ДНК

За търсене на макроскопска ДНК, използвайки Southern blotting. В този метод, геномната ДНК първоначално се фрагментира, използвайки рестрикционен ензим, след което получената

ДНК фрагментите се разделят чрез гел електрофореза, денатурират се и се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана. ДНК на отпечатъка, получен от гела (blot), се инкубира с маркиран фрагмент от изследвания ген, който хибридизира с тези геномни ДНК фрагменти, които съдържат гена. В присъствието на макроскопска ДНК, която засяга този ген, множеството или размерът на фрагментите, с които маркираната проба хибридизира, ще се различава от нормата.

Фиг. 4.4. Хетеродуплексен анализ

ХЕТЕРОДУПЛЕКСЕН АНАЛИЗ Търсенето на микроделеции / инсерции с размер по-малък от 25 базови двойки, както и единични нуклеотидни замествания е по-трудно. За техния анализ често се използват специални варианти на електрофоретични методи. Един от най-простите е хетеродуплексният анализ (фиг. 4.4). В този метод, проба, съдържаща смес от нормалната (референтна) и амплифицирания ДНК фрагмент, който се изследва, се нагрява за денатуриране на ДНК и след това се охлажда с възстановяване на двойно-верижната ДНК структура. Тъй като наличието на малки разлики в нуклеотидната последователност не предотвратява хибридизация, част от получените дуплекси се състои от еталонната и изпитваната ДНК. В областите на референтна и тестова ДНК, различаващи се по нуклеотиден състав, нормалното сдвояване на нуклеотидите е невъзможно и се образува т.нар. Несъответствие. Двуверижната ДНК, която има несъответствие в структурата си, при електрофореза мигрира по различен начин от напълно комплементарен дуплекс, което прави възможно откриването на анормално мигриращи фрагменти след оцветяване на ДНК.

АНАЛИЗ НА ПОЛИМОРФИЗМА НА СЪОТВЕТСТВИЕТО НА ЕДНА ГРАННА ДНК

Друг популярен електрофоретичен метод на мутационен скрининг е конформационният полиморфизъм на конформационния полиморфизъм (SSCP) с една нишка. Принципът на метода се основава на факта, че ако денатурираното чрез нагряване ДНК се охлажда рязко, не се образуват предимно двуверижни дуплекси, а къси двуверижни участъци във всеки едноверижен ДНК фрагмент (фиг. 4.5). Обикновено се образуват няколко относително стабилни варианта, които поради различна пространствена конформация мигрират по различни начини при електрофореза. Областите на вътрешно-верижна комплементарност обикновено са кратки и всяка промяна в резултат на дори еднократна нуклеотидна подмяна обикновено води до изчезване на тази форма на дуплекс на вътрешността. В резултат на това разпределението и интензивността на едноверижните ДНК ленти се променят в електрофореграмата. Този метод не казва нищо за естеството на разликите в нуклеотидната последователност, така че анормалните проби трябва да бъдат подредени.

Фиг. 4.5. Анализ на полиморфизма на едноверижна ДНК конформация

ЕЛЕКТРОФОРЕЗ НА АРХИТЕКТУРАТА НА ДАНА AT ДЕНАТУРАНТСКИ ГРАДИЕНТ По-електрически възпроизводим и информативен от SSCP е ДНК-електрофоретичен анализ в денатуриращ градиент (Фиг. 4.6). Очевидно е, че всяко заместване на нуклеотиди ще доведе до промяна в силата на ДНК дуплекс и ще денатурира в единични вериги при анормална температура или концентрация на денатуриращия агент в сравнение с нормалната последователност. При този метод се извършва електрофореза в полиакриламидни гелове, съдържащи по-висока концентрация на денатурант в долната част, отколкото в горната част. По време на електрофореза, нормалните и мутантни ДНК фрагменти се денатурират в различни части на гела. Тъй като подвижността на получените единични вериги е много по-ниска,

Фиг. 4.6. Електрофореза в денатурантен градиент

от двойноверижната ДНК (поради конформационните характеристики на едноверижна ДНК), денатурираният фрагмент рязко забавя миграцията, докато двуверижният продължава да се движи., В резултат на това нормалните и мутантни ДНК фрагменти мигрират на различни разстояния в гела. Понякога като денатурант не се използва химическо вещество, а температурен градиент.

ДЕНАТУРИРАНЕ НА ЕФЕКТИВНА ТЕЧНОСТ НА ГОРИВО

ХРОМАТОГРАФИЯ Разликите в силата на нормалните и мутантните дуплекси също могат да бъдат открити с помощта на денатурираща високоефективна течна хроматография. В този метод ДНК фрагмент, подобно на описаните по-горе електрофоретични методи, се излага на градиент на денатуриращи агенти, но ДНК анализът се извършва чрез хроматографски метод, използвайки спектрофотометрично откриване. Този метод е много чувствителен и лесен за автоматизиране и затова все повече се използва за клинична ДНК диагностика.

ХИМИЧЕСКО ОТКРИВАНЕ НА НЕПАКОВАНИ НУКЛЕОТИДИ Втората група методи се основава на откриването на мутации, използващи ензими или химична обработка, която конкретно унищожава зоните на не-комплементарно чифтосване.

Анализираният ДНК фрагмент се денатурира, смесва се с контролна проба, съдържаща нормална ДНК, и се охлажда до образуване на дуплекси, някои от които, ако пациентът има мутации, ще съдържа области на несдвоени бази. Третирането на ДНК хетеродуплекс с хидроксиламин или осмиев тетроксид води до модификация на неспарените нуклеотиди, съдържащи цитозин и тимидин. Последващото третиране с пиперидин води до разцепване на ДНК в нуклеотида. В резултат на това, размерът на ДНК се запазва в нормални проби, а мутантните съдържат набор от фрагменти, съответстващи на мутации, засягащи нуклеотиди С или Т. Този метод не се използва широко, вероятно поради високата токсичност на използваните реактиви.

Защита срещу RNKAZY В друг метод, присъствието на неспарени нуклеотиди се определя с помощта на ензима РНКаза. Този метод използва маркирана РНК-сонда, съответстваща на нормална генна последователност, която хибридизира с изследвания ДНК фрагмент (Фиг. 4.7). Като част от дуплексната ДНК / РНК, РНК е резистентна към РНКаза, затова този метод се нарича защита срещу РНКаза. Обаче, в региони, различни от нуклеотидната последователност между пробата и пробата, която трябва да се анализира, не се случва сдвояване на нуклеотиди. Образуването на РНК фрагменти се записва чрез електрофореза. Този метод е една от най-чувствителните и скрининг-специфични мутации, но не е широко използван, очевидно поради неудобството от работа с лабилни РНК сонди. Има и други методи, базирани на ензимното разпознаване на неспарените бази; не е ясно колко широко ще бъдат използвани в клиничната диагноза.

СКРИНИРАНЕ НА ДИАГНОСТИЧНИТЕ МУТАЦИИ Електрофоретичните методи за мутационен скрининг са не-абсолютна чувствителност, те обикновено откриват само около половината от мутациите и полиморфизмите в анализираните фрагменти и само чувствителността на денатуриращите

електрофореза се доближава до 100%. В комбинация с относително ниска цена и възможност за автоматизация, този метод става все по-популярен.

Друга особеност на методите за скрининг е, че при положителни резултати е необходим допълнителен анализ на последователността или рестрикционния ензим, тъй като скрининговите методи не са

Фиг. 4.7. Метод за защита на RNase

дава информация за естеството на нуклеотидните разлики. Когато се провежда ДНК диагностика, не е достатъчно да се открие отклонение в нуклеотидната последователност на пациент, което води до замяна на кодираната аминокиселина. Необходимо е да се потвърди, че това аминокиселинно заместване е функционално значимо. Директният метод се състои в получаване на рекомбинантен мутантен протеин и определяне на неговата активност. Този отнемащ време и скъп подход се използва главно за изследователски цели. На практика, по-често те се ръководят от вида на аминокиселинното заместване. В случаите, когато нормалните и мутантните аминокиселини принадлежат към различни структурни класове, вероятността от функционални промени в протеина е по-висока. Вероятността от дисфункция на протеина е още по-висока, ако мутацията засяга еволюционно запазените части на гена, т.е. онези разпоредби, в които една и съща аминокиселина присъства в няколко вида бозайници. Присъствието на такива места обикновено влияе на синтеза, транспорта или функционирането на протеина и всяка промяна в тях влияе на активността на протеина. Например, анализ на последователността на LDL рецепторния ген на китайския хамстер, заек, плъх, мишка и Xenopus laevis демонстрира, съответно, 81, 79, 77, 76 и 70% хомология на човешкия рецептор. Базата данни UMD-LDLR, достъпна чрез Интернет, съдържа редица програми за анализиране на мутации в гена на LDL рецептора, включително възможността за анализ на консерватизма на всеки ген сегмент.

Допълнителна информация за патогенността на мутацията може да бъде получена чрез изследване на роднините на пациента. В случай, че една и съща мутация присъства при роднини на пациент с признаци на това заболяване (например повишени нива на холестерол при фамилна хиперхолестеролемия), но липсва при здрави индивиди (повече от 100 донори обикновено се скринират без признаци на това заболяване), вероятността, че Тази мутация е патогенна, много висока.

Като цяло, въпреки не-абсолютната чувствителност на методите за скрининг на мутации, съотношението между съдържанието на информацията и цената на тези методи е доста високо и те са широко използвани в практиката. Трябва да се има предвид обаче, че тяхната отрицателна прогностична сила е малка. С други думи, липсата на всякакви характеристики на ДНК пробата, когато се анализира чрез скрининг методи, не означава, че тази ДНК не съдържа мутации.

МЕТОДИ ЗА ОТКРИВАНЕ НА МУТАЦИИ

В случаите, когато са известни възможните варианти на генетични пренареждания и няма много от тях, можете да използвате методи, които са по-бързи и по-евтини от методите на мутационния скрининг. Тези методи се основават или на ДНК хибридизация, или на способността на рестрикционните ензими да разпознават добре дефинирани нуклеотидни последователности или ДНК полимерази за синтезиране на ДНК, която е комплементарна на матрицата (мини-секвениране).

Фиг. 4.8. Анализ на ограничението

АНАЛИЗ НА ОГРАНИЧЕНИЯ Най-простият метод за откриване на мутации е рестрикционният анализ (Фиг. 4.8). В основата на този метод е много висока специфичност на рестрикционните ендонуклеази по отношение на определени нуклеотидни последователности. Всеки от тези бактериални ензими разпознава строго индивидуална последователност от 4-8 нуклеотида и отрязва двойна верига на ДНК вътре или близо до това място. Достатъчно е да замени един нуклеотид, за да наруши ограничението на този ензим. В тези случаи, когато полиморфният нуклеотид е част от рестрикционния сайт, той може да бъде генотипизиран със 100% надеждност, използвайки рестрикционен ензим. Нуклеотидните замествания най-често нарушават съществуващите рестрикционни сайтове, но понякога създават нови сайтове. Недостатъкът на метода е, че полиморфните нуклеотиди не винаги лежат в местата на разпознаване на която и да е рестриктаза. Частично решение е възможно в случаите, когато областта, в която е разположена мутацията, съдържа поне някои от нуклеотидите, които съставят ограничаващото място. Пълно рестрикционно място може да бъде създадено изкуствено по време на PCR. За да направите това, използвайте праймери, които не отговарят напълно на последователността на нуклеотиди в областта на мутацията, но съдържат 1-2 не-комплементарни нуклеотиди, които допълват рестрикционното място, което ще включва полиморфния нуклеотид. Обикновено, въвеждането на малък брой не-комплементарни бази леко намалява ефективността на PCR, следователно, след амплификация, в продукта се появява ново рестрикционно място, в което участва и полиморфният нуклеотид. По-нататъшен рестрикционен анализ се извършва по същия начин, както в стандартния метод.

ALLELSPECIFIC PCR В някои случаи PCR може да се използва, за да не се обогати изследваният фрагмент от геномна ДНК, а да се открие директно мутацията (Фиг. 4.9). В това изпълнение, един от праймерите хибридизира с ДНК област, в която се намира полиморфен нуклеотид. Температурата на отгряване на праймерите се избира така, че свързването на праймера и последващата амплификация става само при пълно съвпадение на ДНК и праймерните последователности. Например, когато праймер, съответстващ на мутантната последователност, се свързва с нормална ДНК, се образува неспарен нуклеотид, който намалява силата на свързващия праймер към ДНК. При достатъчно висок темпериращ температурен праймер

Фиг. 4.9. Алел-специфична полимеразна верижна реакция

обикновено престава да се свързва с нормалния алел, PCR не протича и продуктът не се натрупва. Обикновено, паралелно се поставя реакция с праймер, съответстващ на нормалния алел. Тази реакция служи като положителна контрола, показваща нормалния ход на амплификация. Тъй като наличието на едно несъответствие може леко да намали силата на свързване на праймера към ДНК, понякога се въвежда втора несъответствие в праймерната последователност с цел по-нататъшно дестабилизиране на дуплекса и намаляване на добива на продукта в присъствието на неспарен нуклеотид в полиморфната област.

PCR R REAL REMAINS

Предимството на аллел-специфичния PCR метод, описан по-горе, е намаляването на броя на етапите в процедурата за анализ, тъй като не изисква обработване на продукта с рестриктази или използването на сложни електрофоретични методи.

Нещо повече, методът се ускорява чрез използване на PCR в реално време (RT-PCR). При този метод образуването на продукта не се следи чрез електрофореза, както при стандартния PCR метод, а директно по време на PCR за натрупване на двойно-верижна ДНК в реакционната среда. Натрупването на ДНК се определя след всеки полимеризационен цикъл чрез увеличаване на флуоресценцията на SYBR Green боя или неговите аналози, чиято флуоресценция се увеличава драматично при взаимодействие с двойно-верижна ДНК, но не зависи от наличието на нуклеотиди или праймери. Инструментите за RT-PCR са комбинация от PCR усилвател и флуориметър. След завършване на амплификацията, специфичността на получения продукт може да се определи чрез измерване на точката на топене, която се следи за намаляване на флуоресценцията на SYBR Green.

ТЕХНИЧЕСКА ТЕХНИКА Има и други начини за регистриране на PCR продукт директно в реакционната смес без електрофореза. Методът, патентован от Hofmann LaRoche, се основава на откриването на амплифицирана ДНК, използвайки олигонуклеотидна проба, която хибридизира с централната част на амплифицираната последователност. В краищата на олигонуклеотидните проби, наречени TaqMan, са нуклеотиди, белязани с две различни флуоресцентни багрила, една от които гаси флуоресценцията на другата. В резултат на закаляването нивото на флуоресценция на второто багрило е малко. Taq полимераза, която завършва нова верига от един от праймерите, разделя пробата TaqMan, която се свързва с средата на амплифицираната ДНК област, поради неговата екзонуклеазна активност, в резултат на което флуоресцентно белязаните нуклеотиди се освобождават в разтвора и ефектът на охлаждане изчезва, тъй като се наблюдава само в случай, когато флуорофорите са разположени близо един до друг. В резултат на това, флуоресценцията на багрилото увеличава повече, толкова повече олигонуклеотидни проби се разрушават чрез ДНК полимераза по време на амплификация, т.е. колкото повече продукт се образува. Този метод се използва и за анализиране на мутации. За тази цел се използват две TaqMan проби, маркирани с различни двойки флуорофори и различаващи се в нуклеотидната последователност в полиморфната област, една от които съответства на дивия тип, а другата на мутантния. Деградация на проба от ДНК полимераза

Фиг. 4.10. TaqMan сонди. Р - репортерно багрило, Т - гасител флуоресценция

се провежда при температура, при която се съхраняват само напълно комплементарни комплекси между анализирания фрагмент и пробите. Чрез увеличаване на флуоресценцията на багрилата, които образуват нормалната или мутантна проба, е възможно да се определи кои варианти присъстват в анализираната проба. Този метод ви позволява надеждно да разграничавате хетеро- и хомозиготни носители на мутации.

МОЛЕКУЛЯРНИ ПЕЧЕНИ Друг метод за откриване на мутации, базиран на ефекта на охлаждащата флуоресценция, се прилага в метода на молекулните маяци (фиг. 4.11). Олигонуклеотид се нарича шамандура, неговите 3'- и 5'-краища са обозначени с две багрила, една от които действа като гасител. За разлика от пробите от TaqMan, шамандурите са по-дълги и съдържат близо до краищата на късите допълващи се части, които при обикновена температура се закачат една с друга, за да образуват структура на шпилка. В този случай, боите, разположени в краищата на олигонуклеотида, се приближават един към друг и флуоресценцията на едно багрило се охлажда от друга. В средата на шамандурата нуклеотидната последователност съответства на изследваната ДНК област. След денатуриране чрез нагряване, водещо до топене на секцията с остър връх, сместа от ДНК с буйове се охлажда, което дава възможност да се образува дуплекс на шамандурата с анализираната ДНК. При по-нататъшно охлаждане шпилките се оформят отново в свободните буйове и флуоресценцията намалява. Обратно, в маяци, свързани с анализираната ДНК,

Фиг. 4.11. Метод на молекулярните маяци. Р - репортерно багрило, Т - гасител флуоресценция

багрилата остават отдалечени една от друга и тяхната флуоресценция остава висока. Хибридизирането на тестовата ДНК с кофи, съдържащи нормална или мутантна нуклеотидна последователност в централната част, позволява определянето на генотипа на тестовата ДНК.

ХИБРИДИЗАЦИЯ С ВСИЧКИ СПЕЦИФИЧНИ

Този метод се основава на хибридизацията на тестовата ДНК с олигонуклеотиди, хомоложни на мястото на мутация и околната последователност. Този метод съществува в две форми. Понякога PCR продукт е имобилизиран на твърда основа и белязани олигонуклеотиди са добавени в разтвор. Условията на измиване са подбрани по такъв начин, че дуплексите, съдържащи несдвоени основи, са унищожени. В резултат на това остават само олигонуклеотиди, които са 100% допълващи се към анализираната ДНК. Чрез добавяне на олигонуклеотиди, съответстващи последователно на нормалния или мутантния вариант, е възможно да се определи кой нуклеотид присъства в анализираната ДНК. Във втория вариант на този метод, олигонуклеотидите са имобилизирани върху матрицата, с която белязаният PCR продукт се хибридизира.

Предимството на метода на хибридизация с олигонуклеотиди е възможността за неговата миниатюризация, когато широк набор от олигонуклеотиди са имобилизирани върху микрочип, което ви позволява едновременно да откривате много мутации. Основната трудност на този метод е необходимостта от стриктен подбор на условията за хибридизация и измиване на непълно комплементарна ДНК. Не е ясно доколко широко ще се използва този метод в практическата ДНК диагностика.

ВСИЧКА СПЕЦИФИЧНА ЛИГАЗНА РЕАКЦИЯ Ефективен метод за откриване на еднонуклеотидни замествания и къси пренареждания е лигазната реакция (фиг. 4.12). Анализираната ДНК хибридизира с два олигонуклеотида, единият от които завършва с нуклеотид, комплементарен на полиморфното място, а вторият директно в съседство с него. След края на хибридизацията, ензимната ДНК лигаза кръстосано свързва олигонуклеотидите, за да образува по-дълъг фрагмент, който се различава значително от оригиналните олигонуклеотиди в подвижността.

Фиг. 4.12. Алелна специфична лигазна реакция

с електрофореза. Ако олигонуклеотидите не са напълно комплементарни на ДНК фрагмента и след хибридизацията се образува неспарен нуклеотид в полиморфната област, лигазата не омрежва такива олигонуклеотиди и не се образува дълъг фрагмент. По този начин, чрез провеждане на лигазна реакция с една обща и една от две алел-специфични проби, може да се генотипира ДНК проба за даден нуклеотид.

В този метод, PCR продуктът е хибридизиран с олигонуклеотидно свързване на b'-страна на полиморфизъм (Фигура 4.13). След хибридизацията към реакционната смес се прибавят ДНК полимераза и един от четири модифицирани нуклеотида. В тази реакция се използват флуоресцентно маркирани дидезоксинуклеотиди, в резултат на което ДНК полимераза може да завърши само един нуклеотид, допълващ този, намиращ се в анализираната позиция. Следователно, реакцията ще се осъществи само в тръбата, където се добавя нуклеотидът, допълващ анализирания. В някои случаи, всичките четири нуклеотида присъстват в реакционната смес, но са маркирани с различни багрила. Флуоресцентният анализ на четири дължини на вълната ви позволява да определите кой нуклеотид е активиран и съответно анализираният нуклеотид е комплементарен към него. Тъй като този метод използва същия принцип, както при ензимното секвениране на ДНК, той често се нарича мини-последователност.

Има и други методи за определяне на мутации, базирани на активността на ДНК полимераза. В един от тях, наречен пиросеквениране, всяка стъпка от удължаването на ДНК полимеразна верига се записва чрез образуването на пирофосфат, който се следи с помощта на конюгирани ензимни реакции, което води до избухване на хемилуминесценция в отговор на образуването на пирофосфат (Фигура 4.14). Този метод позволява да се определят само много къси участъци от ДНК, така че основното му използване е да се анализират мутациите. Нуклеотидът, който трябва да се анализира, се идентифицира чрез добавянето на кой от четирите нуклеотида (конвенционалните нуклеотиди се използват в този метод) водят до избухване на хемилуминесценция.

Фиг. 4.13. минисеквенциониране

Фиг. 4.14. Принципът на ДНК последователността

ОТКРИВАНЕ НА МУТАЦИИ Β ДИАГНОСТИКА Когато се използват правилно, методите за откриване определят наличието или отсъствието на мутации с много висока чувствителност и специфичност, което позволява информацията, получена чрез тези методи, да се използва за вземане на много важни решения, като например необходимостта от аборт по време на пренатална диагностика.

Има два метода за пренатална диагностика. Амниоцентезата се състои в избора на около 10 ml околоплодна течност през коремната стена (фиг. 4.15). Оптимален срок

Фиг. 4.15. амниоцентеза

провеждане - 16-та седмица от бременността. Феталните клетки се изолират от течността чрез центрофугиране и веднага се анализират чрез PCR или се поставят в култура. Клетките в културата се делят и след известно време са достатъчни за провеждане на хромозомния анализ, а по-късно - биохимични. Вторият метод, биопсия на хорионна вълна, е възможен в по-ранните стадии на бременността, в седмица 10-12 (фиг. 4.16). Тази процедура се състои от трансабдоминална или транскервикална биопсия на хорионните вълни. Хорионните клетки могат да бъдат култивирани или анализирани незабавно, ако има достатъчно материал за ДНК анализ. Ако се открият хромозомни аномалии или мутации, бременността може да бъде прекъсната от родителите.

Провеждането на пренатална диагностика на мутации има смисъл, когато има надежден метод за откриване на мутацията, която е налице в дадено семейство. В някои случаи може да се определи

Фиг. 4.16. Биопсия на хориона

дали плода наследява наследствено заболяване, без да знае точното място на мутацията, но разчита на анализа на генетичната връзка на заболяването в семейството. Това обаче не винаги е възможно, тъй като за анализа на сливането са необходими ДНК проби от няколко болни роднини и голям брой здрави членове на семейството.

4.5.2. ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ДНК ДИАГНОСТИЧНОТО ПРИЛОЖЕНИЕ

Максималната диагностична стойност на генетичното изследване се наблюдава в случаите, когато има висока корелация между наличието на генетичен дефект и вероятността за развитие на патология, т.е. за заболявания с висока пенетрантност.

Такива заболявания изпитват постоянен натиск от естествения подбор, в резултат на което честотата им в общата популация обикновено е малка. В тази връзка повечето от приложените генетични тестове са свързани с диагностицирането на редки форми на заболявания. Дори най-често срещаните форми на човешки моногенни заболявания, описани по-долу, се проявяват клинично не по-често, отколкото в един човек от няколкостотин.

Често срещаните човешки болести като хипертония, диабет, сърдечно-съдови заболявания, макар и зависими от генетични фактори, имат ниска степен на проникване, сложна, променлива и слабо проучена генетична структура, следователно, въпреки очевидната необходимост от търсене на генетична предразположеност към общи заболявания, резултатите от такива научните изследвания на практика са много ограничени.

ФАКТОРИ НА ЕФЕКТИВНОСТ Съотношението на информативността на резултатите от ДНК-диагностиката и разходите за неговото прилагане до голяма степен се определя от генетичната сложност на заболяването. Примерите включват хемохроматоза, при която две мутации причиняват почти всички клинични случаи сред бялата популация и фамилна хиперхолестеролемия, която може да бъде причинена от повече от 800 мутации в LDL рецепторния ген, нито една от които не е по-често от 1% от пациентите с фамилна хиперхолестеролемия. Повечето наследствени заболявания са междинни в този диапазон, приближавайки се до семейната хиперхолестеролемия, когато цената на ДНК диагностиката може да ограничи нейното прилагане.

При определени условия може да се намали сложността на диагнозата и съответно нейната цена. Това е възможно при популации, при които генетичната структура на заболяването е по-проста, отколкото в други популации. Този ефект е най-силно изразен в популациите с т.нар. Този генетичен термин означава, че значителна част от населението е наследило определена мутация от един от своите предци-основатели. Поради това чисто случайно събитие в тази популация, повечето от случаите на това заболяване са причинени от тази мутация. Типичен пример, свързан с генетичното изследване, е популацията на африканерите, хората от Южна Африка от северноевропейски произход. Съвременните африканци са потомци на малък брой семейства от Холандия, които мигрирали в Африка през XVII-XVIII век. Сред африканерите, семейната хиперхолестеролемия, водеща до ранното развитие на коронарна артериална болест, е няколко пъти по-често срещана, отколкото в европейската или американската популация. Освен това по-голямата част (> 95%) от случаите на фамилна хиперхолестеролемия в южноафриканската бяла популация се дължи на наличието на една от само трите мутации в LDL рецептора. Такава генетична хомогенност рязко контрастира с генетичната структура на фамилната хиперхолестеролемия в други страни, където са описани стотици мутации, нито една от които не е по-често срещана, отколкото при 1-2% от пациентите. Очевидно е, че няколко имигрантски семейства (най-малко три) са имали мутации, сега наричани африканерски, които са станали главната причина за фамилна хиперхолестеролемия при техните потомци. От гледна точка на практическата медицина, молекулярно-генетичното изследване на белите хора в Южна Африка за наличието на фамилна хиперхолестеролемия е сравнително ефективен и сравнително евтин подход, който позволява пресимптомно диагностициране на това заболяване. За разлика от Южна Африка, други страни изискват много по-скъп арсенал от молекулярни методи, за да направят такава диагноза.

За други наследствени заболявания има и разлика в честотата на мутациите между популациите. Например, миссенс мутация cis₂₈₂

Шината в гена на HFE, водеща до развитие на хемохроматоза, е често срещана в европейските популации, където честотата на нейните носители е до 10-15%. За разлика от тях, в африкански, азиатски и австралийски аборигенни популации

Тази мутация е много рядка. Предполага се цис мутация₂₈₂-Гумата произхожда от Европа преди около 2000 години.

В допълнение към ефекта на основателя, вторият биологичен механизъм, който опростява търсенето на мутации дори в генетично отворена популация, е наличието на горещи точки на мутация в гените. Доказано е, че вероятността от поява на мутации се различава в областите на генома с различно съдържание на GC-нуклеотиди. Известна е също така последователността, в която е спряна ДНК полимераза a; в такива региони често се срещат спорадични делеции в различни гени. Поради тези фактори мутациите не са разпределени равномерно по дължината на гена, а са концентрирани в определени области, което опростява тяхното търсене.

Така за ефективна ДНК диагностика е необходима информация за най-честите мутации, водещи до развитието на това заболяване в популацията, към която принадлежи пациентът.

ФАКТОРИ НА ДИАГНОСТИЧНАТА СТОЙНОСТ

При редица наследствени метаболитни нарушения, присъствието на болестта може да се подозира по време на биохимичния анализ. Например, пациентите с фамилна хиперхолестеролемия обикновено имат повишени нива на LDL холестерол, а при хемохроматоза се повишава насищането на трансферин с желязо. Биохимичните параметри подлежат на променливост във всеки индивид. В резултат на това на индивидите, например, с повишени нива на LDL холестерол, се препоръчва да повторят тестовете с интервал от 3 месеца, за да се уверят, че откритото метаболитно отклонение е надеждно. В някои случаи биохимичните показатели са в така наречената сива зона, което допълнително усложнява диагнозата. Това е мястото, където ДНК диагностиката може да помогне. Наличието на мутация показва усреднената предразположеност през целия живот, за да се измести този биохимичен параметър към патологичната страна, така да се каже, патологична готовност. За разлика от биохимичния фенотип, генотипът не подлежи на индивидуални и популационни вариации, характерни за биохимичните параметри. По този начин ДНК диагностиката позволява да се потвърди биохимичната диагноза по независим метод, както и да се изключи наличието на други причини за това биохимично нарушение. Очевидно е, че максималната информативност на ДНК диагнозата на наследствени метаболитни нарушения се постига, когато се комбинира с класически биохимични методи.

При обсъждането на спецификата и чувствителността на методите за диагностика на ДНК, първо трябва да се определи какво е заложено - определянето на специфична мутация или търсенето на неизвестно генетично заболяване у пациента. В случай на специфична мутация, за която са разработени надеждни методи за откриване, чувствителността и специфичността на откриването са близки до 100%. За да се определи диагностичната стойност на общия молекулярно-генетичен тест, е необходимо да се вземе под внимание чувствителността на откриването на мутации в комбинация с тяхната пенетрация.

Положителната диагностична стойност на теста до голяма степен се определя от проникването на мутациите. Например, откриването на тризомия на хромозома 21, или мутации, специфични за мускулната дистрофия на Дюшен или болестта на Хънтингтън, предполага, че тези индивиди с вероятност близо до 100% имат или ще развият по-нататък съответния клиничен синдром. Такава висока положителна диагностична стойност обаче не е типична за всички генетични тестове. При мутации с ниска степен на проникване, например при носители на мутации на хемохроматоза, вероятността за развитие на клинични прояви не надвишава няколко процента. В такива случаи откриването на дефект показва само предразположение към развитието на това заболяване, което силно зависи от наличието на допълнителни наследствени фактори и фактори на околната среда.

Колкото по-проста и по-изучена е генетичната структура на това заболяване, толкова по-лесно е да се открие мутацията и колкото по-висока е чувствителността на теста. За съжаление, по-голямата част от генетичните заболявания са причинени от широк спектър от мутации, често намиращи се в различни гени. В комбинация с ограничените възможности на съвременните молекулярни методи, това намалява чувствителността на молекулярно-генетичните тестове. Например в момента, дори и в най-добрите молекулярно-генетични лаборатории, работещи с пациенти със семейна хиперхолестеролемия, мутациите могат да бъдат открити само при половината от пациентите с потвърдена клинична диагноза. Друг пример е миодистрофията на Дюшен. В този случай делеционното заболяване в гена дистрофин може да бъде открито само в 70% от случаите, а останалите пациенти се нуждаят от допълнителен хистологичен анализ на мускулната биопсия. В случаите, когато тестът не е в състояние да открие всички генетични промени, които водят до заболяването, неговата отрицателна прогностична сила е ниска.

В определени ситуации отрицателната прогностична сила на ДНК тестовете може да бъде много висока. Става дума за пренатална и пресимптомна диагностика в случаите, когато са известни патогенни мутации, които са налице в родителите. В такава ситуация, високата точност на молекулярните методи позволява с достатъчна надеждност да покаже не само присъствието, но и отсъствието на родителски мутации в плода или детето.

Обобщавайки, можем да кажем, че повечето молекулярно-генетични тестове имат значителна положителна прогностична сила, което го прави препоръчително да се използват в клиниката, особено в случай на висока пенетрантност и патогенност на мутациите. Обратното, отрицателната прогностична сила на повечето молекулярни тестове е малка, освен когато е известно кои мутации са в родителите.

4.5.3. ПРИМЕРИ ЗА ИЗПОЛЗВАНЕ НА ДНК ДИАГНОСТИКА В КЛИНИКА

Както е добре известно, класическата медицинска генетика описва моногенни високо пенетрантни и клинично сериозни заболявания. Честотата на такива заболявания обикновено не надвишава 1 на 5000 население. Около хиляда моногенни наследствени заболявания могат да бъдат открити чрез ДНК анализ. Списъкът на тестовете и лабораториите, които ги изпълняват, се актуализира постоянно в интернет (http://www.geneclinics.org). Повечето ДНК диагностики сега се използват в генетичното консултиране и пренатална диагностика, за да се предотврати раждането на деца с патология.

Въпреки това, в допълнение към класическите моногенни случаи, често се срещат наследствени заболявания в клиниката, които се характеризират с относително ниска пенетрация и сравнително лек ход. Традиционно те се приписват на моногенни, но натрупаните данни напоследък показват по-олигогенна природа на тези заболявания.

Следва подробно обсъждане на няколко обичайни човешки олигогенни заболявания, като хемохроматоза, наследствена тромбофилия, фамилна хиперхолестеролемия, кистозна фиброза и хипертрофична кардиомиопатия. Хетерозиготни носители на мутации, водещи до тези заболявания, се срещат в популацията с честота от 1 на 500 до 1 на 20 души. Поради високата популационна честота на заболяването в тази група, значителна

общ принос към патологията на човека, вероятно надвишаващ приноса на редките наследствени заболявания. За всички тези заболявания, ДНК тестовете позволяват пресимптомна диагноза, както и за хемохроматоза, тромбофилия и хиперхолестеролемия и последваща профилактика, както фармакологично, така и чрез промяна на начина на живот.

Това е едно от най-често срещаните генетични метаболитни нарушения, наречени вродени метаболитни грешки Хемохроматозата (ГХ) се среща при 1 от 200-300 души в Северна Европа.

Класическата триада - диабет, цироза и пигментация на кожата („бронзов диабет“) е описана още през 1865 г., а през 1935 г. е доказана фамилната природа на това заболяване. В основата на клиничните прояви на GC е биохимичен дефект - прекомерно натрупване на желязо в паренхимните клетки на черния дроб, панкреаса, сърцето и предната хипофизна жлеза. За да се предотврати развитието на клинични прояви, можете да използвате много прост и същевременно ефективен начин - превантивна флеботомия. Междинният GC фенотип е повишено ниво на желязо в плазмата и черния дроб, което се оценява чрез различни биохимични тестове, като насищане с трансферин с желязо, концентрация на феритин и съдържание на желязо в черния дроб.

Клиничните прояви на ГХ са много разнообразни. Едно от най-честите прояви е хроничното увреждане на паренхимата на черния дроб. Характерна особеност е общото или локалното усилване на пигментацията на кожата. 30-60% от пациентите с напреднало заболяване имат диабет. В ранните стадии на GC се проявяват неспецифични симптоми като летаргия, хепатомегалия, артропатия, кардиомиопатия, диабет, хиперпигментация на кожата или хипогонадизъм. Клиничните прояви зависят от генетични и външни фактори, като съдържанието на желязо в храната, кръводаряването и физиологичната загуба на кръв при жените по време на менструация.

През 1996 г. е идентифициран ген, който е отговорен за най-често срещаната форма на GC, която се нарича HFE. Този ген кодира трансмембранен протеин, състоящ се от къс цитоплазмен домен, трансмембранна област и три извънклетъчни домена, които взаимодействат с Р t₂-микроглобулин върху клетъчната повърхност. HFE протеинът се свързва на повърхността на ентероцита с рецептора на трансферина и намалява афинитета за пренасяне на трансферин.

желязо. При липса на функционално активен HFE, свързването и последващата ендоцитоза на трансферина се повишават, което води до натрупване на желязо вътре в клетката, където се съхранява като комплекс с феритин. Сред пациентите от келтски произход с клинично тежка ГХ, около 90% са хомозиготни за цис мутацията₂₈₂-Гумата в HFE гена и повечето от останалите имат комбинация от Cys₂₈₂-Tyr и друга мутация - GiS_OS-Asp. В резултат на мутация Cis₂₈₂-Тир нарушава образуването на дисулфидна връзка в един от извънклетъчните домени на протеина HFE, неговата конформация е нарушена и протеинът остава след синтеза в ендоплазмения ретикулум. В резултат на това протеинът престава да се експресира върху клетъчната повърхност, което води до засилено улавяне на желязо, което е недостатъчно за нуждите на организма. При повечето еврейски популации честотата на хетерозиготни носители на алел Cis₂₈₂-Диапазонът е около 10%, а за баските и ирландците от келтския произход, честотата на този полиморфизъм може да достигне 30%. За разлика от европейците, тази мутация почти никога не се среща в монголоидите и негридите. Предполага се цис мутация₂₈₂-Тирът е възникнал преди около 2000 години в келтското население и се е разпространил в цяла Европа поради миграцията на населението, т.е. причината за високата честота на тази мутация е основателят.

Има и други заболявания с клинична картина, наподобяващи класическия GC от семейството (също класифицирани като тип 1 GC), но с различен произход. Ювенилният GC (тип 2), както и GC от тип 1, се наследяват по автозомно рецесивен начин и се причиняват от мутации в неизвестен ген. GC от тип 3 също е рецесивно заболяване и е свързано с мутация в рецептора на трансферин. GCs на 4-ти и 5-ти тип се наследяват доминиращо и се причиняват от мутации в гените на феропортин, транспортиращи желязото в червата, и съответно феритин. Всички тези форми са много редки и днес тяхното определение не играе практическа роля.

Гумата в HFE гена се характеризира с висока пенетрантност по отношение на междинния фенотип, т.е. биохимичния признак на излишък на желязо в тялото. 95% от мъжете над 40 години, които са хомозиготни за тази мутация, имат излишък от желязо и има клинични признаци и симптоми. Пременопаузалните жени имат по-нисък риск от загуба на кръв по време на

менструация. Фенотипният ефект на GiS мутацията_OS-Asp е по-слабо изразен. Фиброза или цироза на черния дроб се откриват чрез анализиране на биопсия при 4-25% от хомозиготни носители на алел Cis.₂₈₂

Стрелбище В допълнение, алел Cis₂₈₂-Tir предразполага към развитието на хепатоцелуларен карцином. При мъже с ГХ и цироза относителният риск от развитие на хепатоцелуларен карцином е 200 пъти по-висок.

ИЗПИТВАНЕ ЗА МЕДИИ

Наличието на горните симптоми е индикация за генетично изследване на GC. Въпреки това, диагнозата се поставя по време на разширената клинична картина, когато е твърде късно за предотвратяване на първичния дефект. В тази връзка много изследователи се застъпват за необходимостта от скрининг на населението за наличието на GC. Това заболяване отговаря на много от изискванията за заболявания, подложени на скрининг, т.е. настъпва доста често, има латентна фаза пред клинични прояви, лесно се диагностицира с биохимични и генетични методи и може да се предотврати с помощта на ефективно и евтино лечение.

Засега обаче масовият скрининг се счита за преждевременен поради неясноти, свързани главно с проникването на GC. Определено е препоръчително да се тестват роднините на пациенти с ГХ, които трябва да измерват нивото на насищане на трансферина с желязо, съдържанието на феритин и биохимичните маркери на чернодробната дисфункция, както и да се определи наличието на мутации в HFE гена по позиция 282 и 63.

От техническа гледна точка, откриването на тези мутации не е трудно. Обикновено се използват рестрикционен анализ или различни форми на алел-специфична амплификация или хибридизация.

4.5.3.2. Наследствена тромбофилия

Тромбофилия - тенденция към развитие на тромбоза, свързана с вродени и придобити нарушения на кръвосъсирването и фибринолиза. Тромбофилията най-често се среща като венозна тромбоза и тромбоемболия, които се срещат с честота около 1 на 1000 популации годишно.

Има фамилни форми на тромбофилия, описани още през 50-те години. Първите идентифицирани причини за наследствена тромбофилия (NTF) са дефицит на антитромбин III,

По-късно, още две форми на NTF бяха идентифицирани - мутация на коагулацията на фактор V, която предизвиква резистентност на фактор V към активиран протеин С и мутация в протромбиновия ген G20210A, което повишава нивото на протромбин в плазмата. В допълнение, умерената хиперхомоцистеинемия, често свързана с широко разпространен полиморфизъм в MTHFR гена, също е рисков фактор за венозна тромбоза.

Тромбоемболична комбинираност Тежестта на клиничните прояви на NTF варира значително. Често те протичат в много лека форма и тяхното присъствие може да се определи само чрез лабораторни методи. В много случаи обаче носителите на мутации развиват дълбока венозна тромбоза на долните крайници, белодробен тромбоемболизъм, повърхностен тромбофлебит, както и венозни тромбози на друга локализация. Тези наследствени дефекти обикновено не са свързани с риска от артериална оклузия. NTFs предразполагат към развитието на тромбоза в ранна възраст: до 40% от пациентите на възраст под 45 години с непровокирана тромбоза на дълбоките вени имат една от формите на NTF. При по-възрастни пациенти или при наличие на провокиращи фактори NTF се наблюдава в 30% от случаите на тромбоза. При пациенти с комбинация от наследствени дефекти, рискът от тромбоемболични усложнения е допълнително увеличен.

Наследственият дефицит на антитромбин III и протеини С и S се среща по-малко от 1% от населението, но при пациенти с венозен тромбоемболизъм (ВТЕ) той се открива в почти 10% от случаите. Рискът от ВТЕ при такива пациенти е 5-8 пъти по-висок, отколкото в общата популация. Причините за дефицита на тези естествени антикоагуланти могат да бъдат намаление на техния синтез или (по-често) намаляване на функционалната активност на протеина, като същевременно се поддържа нормално ниво. Дефектите на протеиновия синтез или функциониране са причинени от стотици различни мутации в тези гени.

Наследствената резистентност към активиран протеин С е най-честата причина за NTF. В повече от 95% от случаите, резистентността се причинява от миссенсна мутация в гена на фактор V, наречен Leyden, в който в позиция 506 аргининът се замества с глутамин. Този аминокиселинен остатък обикновено причинява протеолитично разцепване на фактор V от активиран протеин C. Протеин С е естествен антикоагулант, който се активира от тромбин-тромбомодулин.

комплекс върху ендотелни клетки и разрушава фактори V_а и viii_а, което води до спиране образуването на тромби. Този процес се ускорява значително в присъствието на протеин S, който действа като протеинов кофактор В. Ако има аминокиселинно заместване във фактор Va Arg₅₀₆-Gln активираният протеин С не може да го разгради, което води до запазване на активността на фактор Vа и повишено тромбообразуване (фиг. 4.17).

Мутацията в Лайден се среща почти изключително сред бялата раса, в която около 5% от населението са носители. Поради високата честота на тази генетична форма в общата популация, тя трябва да се отнася до полиморфизма

Фиг. 4.17. Устойчивост на активиран протеин С, причинен от мутацията на Лайден.

в литературата името на мутацията е фиксирано към него. Сред пациентите с ВТЕ честотата на тази мутация е по-висока и е около 20%. Рискът от ВТЕ при носителите на мутацията в Лейден зависи от дозата на гена: при хетерозиготите тя се увеличава 2-7 пъти, а при хомозиготите - 40-80 пъти. Общата вероятност за развитие на тромбоемболия по време на живота на носителите на тази мутация е 30%.

Полиморфният алел G20210A в 3'-нетранслирания регион на протромбиновия ген в общата популация се среща с честота от 2%, но при пациентите с ВТЕ делът на носителите на полиморфизъм нараства до 7%. По този начин, присъствието на полиморфизма на G20210A в протромбиновия ген увеличава риска от ВТЕ около 3 пъти. Патологичният ефект на този полиморфизъм е да се повиши активността на протромбин в плазмата. Нивото на протромбин в АА хомозиготи е 1,5 пъти по-високо от това на хомозиготите в нормалния алел на GG, което допринася за тромбоза. Очевидно, G → A мутацията се отнася до типа мутации с придобиването на функция, тъй като повишава ефективността на обработката на 3'-края на иРНК, което води до натрупване на тРНК и увеличаване на синтеза на протромбиновия протеин.

Друг предразполагащ фактор за тромбоза е повишено ниво на хомоцистеин, аминокиселина, образувана по време на метаболизма на метионина. Умерено повишаване на хомоцистеина увеличава риска от артериална и венозна тромбоза. Причината за увеличаването може да бъде или анормална диета (липса на пиридоксин, кобаламин, фолат), или генетични фактори, като например полиморфизъм на А1.₆₇₇

Валът в гена метилентетрахидрофолат редуктаза - ензим, който играе важна роля при определяне нивото на хомоцистеин в плазмата. Активността на този вариант на ензима е само около 1/3 от нормата. Приблизително 10% от бялата раса са хетерозиготни носители на този полиморфизъм. Честотата на ВТЕ в изолираните носители на този полиморфизъм не се различава от нормалната, но редица данни показват, че полиморфизмът на С677Т допринася за проявата на други NTFs.

БЕРЕМЕНАЛНОСТ И АКУШЕРСКА ПАТОЛОГИЯ По време на бременността се повишава нивото на витамин К-зависими фактори на кръвосъсирването, намалява се съдържанието на протеин S и фибринолизата се инхибира. Тези промени са физиологично осъществими, тъй като са насочени към намаляване на загубата на кръв по време на раждане, но също така увеличават вероятността от ВТЕ по време на бременност (2,5 пъти) и особено в периода след раждането (20 пъти).

При наличието на NTF, тази вероятност е дори по-висока и може да достигне 100-кратно в хомозиготите за мутацията на Лейдън на фактор V. Повечето (до 60%) от жените с ВТЕ, които са се развили по време на бременността, имат мутация от Лейден.

В допълнение към венозния тромбоемболизъм, NTFs допринасят за развитието на акушерска патология. Нарушаването на пълната маточна плацентарна циркулация, дължаща се на тромбоза, може да доведе до различни усложнения на бременността, като спонтанен аборт, мъртво раждане, разкъсване на плацентата, прееклампсия и вътрематочно забавяне на растежа. Многобройни проучвания показват повишена честота на NTF при пациенти с тези усложнения. Има и доказателства, че наличието на мутация не само при майката, но и при плода може допълнително да увеличи риска от тромбоза и инфаркт на плацентата, което води до загуба на плода. Относителният риск от усложнения при бременност при хетерозиготни носители на мутацията на Leiden или полиморфизма на протромбиновия ген G20210A според различни изследвания се е увеличил средно 2-3 пъти.

Приемането на орални контрацептиви също допринася за развитието на ВТЕ. Този ефект се увеличава при жени с NTF. Рискът от развитие на ВТЕ при носители на мутации в Лайден, приемащи орални контрацептиви, според различни оценки, се увеличава с 20-65 пъти. При наличие на протромбин G20210A, рискът от ВТЕ е малко по-нисък, но също значително надвишава нормалната стойност. Въз основа на тези наблюдения се препоръчва да не се използват орални контрацептиви за жени с дефицит на естествени антикоагуланти, хомозиготи за мутацията на Leyden и при наличие на комбинирани дефекти.

Хормонозаместителната терапия след менопауза е друго ятрогенно състояние с 2-4-кратно увеличение на риска от ВТЕ. При наличие на мутация в Лайден, относителният риск може да се увеличи с 15 пъти, а честотата на повтарящата се тромбоза също се увеличава. В тази връзка, носители на NTF, които са имали епизоди на ВТЕ, се препоръчва да не се използва хормонална заместителна терапия.

ПОКАЗАНИЯ ЗА ГЕНЕТИЧЕН АНАЛИЗ Анализът на мутацията на Лайден и протромбиновия полиморфизъм G20210A, както и определянето на дефицита на антитромбин и протеини С и S, е ефективен метод за идентифициране на лица с повишен риск от тромботични състояния. Откриването на тези мутации позволява на носителите да провеждат профилактична антикоагулантна терапия.

Поради ниската абсолютна честота на ВТЕ, масовият скрининг на популацията за наличие на NTF не е оправдан. Счита се за по-подходящо да се изследват следните групи пациенти за наличието на NTF:

• лица с ВТЕ, независимо от възрастта и тежестта на проявите;

• жени с един или повече спонтанни аборти в късен етап или с два или повече спонтанни аборта;

• бременни жени с вътрематочно забавяне на растежа или разкъсване на плацентата;

• роднини на първата степен на родство на пациента с НТФ в историята;

• жени с фамилна анамнеза за NTF преди употреба на орални контрацептиви, хормонозаместителна терапия или бременност.

ДИАГНОСТИЧНИ ИЗПИТВАНИЯ Високо приоритетни тестове за наличие на NTF включват следното:

• определяне на антитромбиновата активност (амидолитичен метод);

• определяне на активността на протеин С (коагулометричен или амидолитичен метод);

• определяне на концентрацията на протеин S (обща и свободна антигенна фракция);

• коагулометрично определяне на устойчивостта на активиран протеин С;

• определяне на Лейденската мутация на фактор V;

• определяне на протромбинов полиморфизъм G20210A;

• определяне на нивата на хомоцистеина в плазмата.

Както може да се види от горния списък, дефицитът на антитромбин и протеини С и S се определя чрез функционални методи. Това се дължи на факта, че тези дефекти са причинени от голям брой мутации и за да ги идентифицират изисква много усилия и разходи, докато функционалните анализи са прости и надеждни.

Анализът на мутацията на Лайден и протромбиновия полиморфизъм е прост и добре допълва функционалните тестове. Очевидно, анализът на C677T полиморфизма в метилен тетрагид рофолатредуктазния ген няма отделна диагностична стойност и трябва да се използва в комбинация с биохимичното определяне на плазмената концентрация на хомоцистеин. Използването на този набор от тестове позволява да се установи наследствен дефект на коагулационните фактори или увеличаване на хомоцистеина при приблизително 40% от пациентите с ВТЕ.

Най-надеждният метод за идентифициране на мутацията на Лейден и протромбин G20210A е рестрикционен анализ, но също така широко се използват алел-специфични PCR и хибридизация.

4.5.3.3. Фамилна хиперхолестеролемия

Фамилната хиперхолестеролемия (FHC) е очевидно най-честото автозомно доминантно човешко заболяване. Честотата на FHD в повечето популации е 1 на 500. В популациите с основополагащ ефект хетерозиготните форми са много по-чести: 1 на 70 в африканерите в Южна Африка и 1 на 200 в канадците с френски произход. По същата причина честотата на FHDs във финландците, друзите и ливанците се увеличава.

Не всички случаи на ГХК се диагностицират клинично. Например, в Русия по-малко от 1% от пациентите с ГКХС поставят клинична диагноза, а най-ефективната диагноза (над 40% от идентифицираните носители) се извършва в Исландия поради малкия брой на населението с изразен основател и малка вариабилност на променливостта.

Основните диагностични характеристики на СГХС са повишеният холестерол в кръвта, наличието на сухожилни ксантоми при пациент или роднини от първа степен и доминиращият модел на наследяване на повишен холестерол или исхемична болест на сърцето.

Клинично, SGHS се проявява с повишен риск от атеросклероза и нейните усложнения. Механизмите, свързващи повишаването на холестерола с развитието на коронарна артериална болест, не са напълно изяснени. Предполага се, че високото ниво на богат на холестерол LDL допринася за тяхното проникване в стената на съда, където окисляват и задействат верига от клетъчни реакции, водещи до натрупване на липиди и локална реорганизация на стената на съда, което води до атеросклеротична плака. В случай на FHC, рискът от смърт от миокарден инфаркт в млада възраст - до 40 години - се увеличава 100 пъти. При нелекувани мъже с FHD до 60-годишна възраст вероятността от CHD е около 75%. Според някои оценки само половината от мъжете с SGHS живеят на 60 години. Средната възраст на появата на ИБС е 40-45 години за мъжете, а за жените е 10 години по-възрастна. По този начин коронарната артериална болест при пациенти с FHD се развива 10–20 години по-рано от средната за населението.

Статини и други липидо-понижаващи лекарства се използват ефективно за намаляване на плазмените нива на липопротеини в SHHS.

Най-тежките пациенти (като правило, те са хомозиготни случаи) се лекуват чрез отстраняване на излишния LDL чрез плазмен обмен. Понякога се използва трансплантация на черен дроб.

БИОХИМИЧНИ И ГЕНЕТИЧНИ МЕХАНИЗМИ

Когато SGHS холестерол се увеличава поради увеличаването на LDL в плазмата. Това метаболитно разстройство е свързано с намаляване на клирънса на LDL от черния дроб в резултат на намаляване на експресията или активността на клетъчните рецептори, медииращи поемането на LDL частици (LDL рецептори). Активността на LDL рецептора в FHCS намалява при всички клетки, експресиращи този рецептор, но функционалните последици са свързани главно с дефект в рецептора в черния дроб, тъй като нарушаването на превръщането на холестерола в жлъчните киселини води до намаляване на екскрецията му през червата. Подобни биохимични аномалии се наблюдават с мутационна промяна в протеин apoB-100, който е лиганд за LDL рецептора. В резултат на тази мутация, LDL частиците вече не се разпознават от LDL рецептора и се натрупват в плазмата.

LDL рецепторният ген съдържа 18 екзона, които кодират шестте функционални домена на този протеин: сигнален пептид, лиганд-свързващ домен, домен, хомоложен на предшественика на епидермалния растежен фактор, O-гликозилиращ сайт, трансмембранни и цитоплазмени домени. Всички известни мутации в LDLR гена се събират в базата данни UMD-LDLR, която е достъпна чрез Интернет. Броят на записите в него надхвърля 800 и продължава да расте. Според базата данни на UMD-LDLR, еднократните нуклеотидни замествания представляват 90% от всички мутации в LDLR гена, повечето от които са мисенси и безсмислени мутации. Останалите 10% са предимно макротрансформации, причинени от неравномерна рекомбинация с повече от 30 копия на Alu последователности, присъстващи в този ген. По-малко от 10 мутации бяха открити в промотора.

Въпреки че SGHS е моногенно заболяване, фенотипното изразяване, а именно тежестта на ИБС, варира значително дори при пациентите, носещи същите мутации. Някои пациенти живеят до 80 или повече години, докато други умират от инфаркт на 20 години. Фактори, влияещи върху клиничните прояви, могат да бъдат външни, метаболитни и генетични.

От факторите на околната среда особена роля играят пушенето и хранителните навици. Пушенето е един от най-силните предиктори на смъртността от коронарна болест на сърцето при пациенти с FHD. Ролята на диетата в развитието

FHCS се демонстрира чрез сравняване на пациенти с китайски произход, живеещи в Канада, с носители на същите мутации, но живеещи в Китай.

Канадските китайци имат LDL холестерол с 70% по-висок от този в Китай. В допълнение, 6 от 16-те хетерозиготи, живеещи в Канада, са имали ксантоми, а 4 са имали CHD. Нито един от 18 анкетираните, живеещи в Китай, не е имал ксантома или исхемична болест на сърцето. Очевидно такива разлики в клиничните прояви са свързани с различна консумация на ненаситени мазнини. Този пример ясно илюстрира модифициращия ефект на външни фактори, като диета, върху фенотипа на хетерозиготния SHKS.

Ходът на заболяването силно зависи от вида на мутацията, причиняваща хиперлипидемия. Най-тежката хиперхолестеролемия се развива в присъствието на нулеви мутации, водещи до пълно отсъствие на активния рецептор, докато мутациите със запазване на частичния синтез или активността на LDL-рецептора обикновено причиняват по-лека болест.

Съществуват редица биохимични параметри, които променят развитието на коронарната артерия при пациенти с SHHS. Тези метаболитни фактори са: HDL холестерол, С-реактивен протеин и фибриноген. Някои от тези фактори, като HDL-холестерол и липопротеин Lp (a), имат изразена генетична основа. Други доказани или предполагаеми генетични фактори включват мутации в липопротеин липазния ген - аполипопротеин Е изоформи, праймери холестерол естерни протеинови варианти, параоксаназен полиморфизъм (липиден пероксид ензимен полиморфизъм), специфичен генотип на метилен тетрахидрофолат (свързан с повишено ниво на хомоцистеин). както и микрозомален триглицерид-носещ протеин, засягащ секрецията на VLDL.

Така, генетично, мутациите на LDL рецептора са основният фактор, определящ развитието на FHC. Приносът на други гени е неоспорим, но поради относително малкия брой пациенти с идентифицирани мутации на LDL рецептор, се изискват допълнителни изследвания на модификаторни гени. В идеалния случай, определянето на генотипа на пациента чрез тези допълнителни гени ще направи възможно да се определи степента на риск от коронарна болест на сърцето и други усложнения в носители на определена мутация в LDL рецептора или гена на апоВ-100.

Индивидуалното ниво на холестерола е обект на естествени промени, така че не може да се направи заключение на базата на едно измерване на холестерола

относно наличието на SGHS. В допълнение, нивото на холестерола зависи от възрастта, пола и варира в различните популации. Нивото на холестерола във FHCS често надвишава средното ниво в общата популация, следователно е невъзможно да се направи диагноза, основана само на резултатите от измерването на плазмения холестерол в някои случаи.

Понастоящем откриването на мутации в LDL рецептора или гена apoB-100 е общ критерий при диагностицирането на FHC. Мутация при 3500-ия нуклеотид в гена apoB-100 (фамилен дефект на apoB) е най-честата причина за FHC в повечето популации. В Европа и в страните, където живеят хора от Европа (Австралия, САЩ, Канада и Нова Зеландия), тази мутация се причинява при 3-5% от пациентите с ГКНС. В страни със сложна генетична структура на заболяването мутациите могат да бъдат намерени в 30-50% от пациентите с клинична диагноза на SGHS. Това се дължи както на неадекватната чувствителност на скрининговите методи, така и на неправилната диагноза, установена въз основа на нивото на холестерола и клиничните прояви. Съществува и възможността за съществуването на допълнителни гени, в допълнение към LDLR и APOB, мутации, при които са придружени от подобна клинична картина.

В редица популации ДНК-диагностиката на SGHS е значително опростена поради наличието на ограничен брой мутантни алели.

Въпреки това, в повечето генетично отворени популации, към които принадлежи Русия, не се открива единична мутация в LDL рецепторния ген по-често, отколкото при 1% от пациентите с ГКХ и обикновено много по-рядко. В тази връзка, скрининговите методи за търсене на мутации, като например определяне на едноверижна ДНК конформационна полиморфизъм, последвано от потвърждаване чрез секвениране, играят важна роля в ДНК диагностиката на FHCS.

4.5.3.4. Кистозна фиброза

Кистозната фиброза (CF) е една от най-честите и в същото време тежки автозомни рецесивни заболявания при хората. Сред европейците честотата на превозвача е около

От 1 до 50, и клинични форми се наблюдават в зависимост от района с честота от 1 до 2-3 хиляди души.

CF получава името си от характера на микроскопските промени, наблюдавани в панкреаса при такива пациенти. Заболяването засяга и белите дробове, черния дроб, тънките черва и мъжката репродуктивна система. Ключова роля в патогенезата играе прекомерното отделяне на слуз от епитела на тези органи, което води до запушване на бронхите или отделителните канали на черния дроб и панкреаса. Въпреки значителното подобрение на симптоматичното лечение, пациентите с МВ обикновено не живеят повече от 20-30 години. Основната причина за смъртта е увреждане на белите дробове, причинено от запушване на бронхите, което създава благоприятна среда за вторични инфекции. Хроничните инфекции и възпалителната реакция водят до фиброза на белодробната тъкан, която в комбинация с обструкция на дихателните пътища може да предизвика дихателна недостатъчност. При 65% от пациентите блокирането на панкреатичните канали предотвратява секрецията на храносмилателни ензими в червата, което води до нарушения в храносмилането. По същия начин, нарушение на секрецията на жлъчката от черния дроб, наблюдавано при 5% от пациентите. В допълнение към тези прояви, 10% от новородените развиват обструкция на тънките черва, изискващи хирургическа интервенция. В допълнение, 95% от мъжете с МВ имат безплодие. Характерна особеност на CF, която се използва широко за диагностициране, е повишената соленост на потта, свързана с нарушена C1 реабсорбция

епител, покриващ каналите на потните жлези.

KF се причинява от мутации в протеина, кодиран от гена CFTR (трансмембранен регулатор на кистозната фиброза). Този ген се състои от 27 екзона и кодира протеин с молекулна маса от 168 kDa, който съдържа два трансмембранни домена, два вътреклетъчни домена за свързване на нуклеотиди и регулаторен домен. Този протеин е канал за C1-йони. Този канал се активира от сАМР-зависима протеинова киназа, която фосфорилира регулаторния домен. Изход С1 - от клетката започва верига от реакции, които водят до затваряне на Na + каналите и засилват производството на мукозна секреция.

Най-честата причина за CF е заличаване на три нуклеотида в 508-ия кодон, което води до загуба на фенилаланин. Честотата на тази мутация при пациенти с CF варира от 50% в Централна Европа до почти 90% в Северна. В резултат на тази мутация, нормалната обработка на протеина е разрушена и след синтеза тя не се транспортира в плазмената мембрана, но се запазва в ендоплазмения ретикулум и се разгражда. Въпреки това, има голям брой

други мутации, увреждащи този протеин; Тези по-редки мутации могат да имат различен ефект върху хлоридния канал, например, частично или напълно да намалят протеиновия синтез, да нарушат неговия вътреклетъчен транспорт или да намалят функционалната активност на канала. Някои от тези мутации причиняват само частично намаляване на синтеза или активността на канала, което може да доведе до различни функционални прояви. В тези случаи, когато се запазва по-малко от 3% от активността, се развива тежка КФ, придружена от лезия на панкреаса. Ако спестите 3-8% от активността засяга белите дробове, а панкреасът е нормален. Ако активността на канала С1 е 8-12%, се наблюдават леки форми, като азооспермия при мъжете. Въпреки това, такава проста връзка не винаги се спазва. Предскажете хода на заболяването е възможно само ако има хомозиготност за делеция на фенилаланин-508 или едновременното присъствие на тази делеция и G551D мутацията. При наличието на тези мутации, заболяването протича в класическа тежка форма с лезия на панкреаса. В повечето други случаи е трудно да се предвиди връзката между вида на мутацията и проявата на заболяването. Налице е нарастващо доказателство, че CF е олигогенна болест и нейните фенотипни прояви зависят не само от природата на мутацията, но и от множеството модифициращи гени, присъстващи в пациента.

МВ почти винаги може да се диагностицира в пренаталната фаза, като се използва ДНК анализ от хорионни вили, или чрез директно определяне на мутации, или чрез използване на анализ на връзката, използвайки полиморфни интрагенични маркери в случаите, когато мутации при болно дете са неизвестни. В момента се обсъжда въпросът за скрининг на популацията за наличие на МВ. Натрупаната информация за генетичната структура на CF ни позволи да изберем 30 мутации от почти 1000 познати, които обаче обясняват 90% от случаите на CF в различни региони на Европа и САЩ. Технически, ДНК-диагностиката на CFs е доста добре развита и са създадени редица търговски комплекти за неговото прилагане.

4.5.3.5. Хипертрофична кардиомиопатия

Хипертрофичната кардиомиопатия (HCM) е едно от най-често срещаните човешки заболявания с изразена генетична предразположеност. Той се среща с честота 1 на 500, което е значително по-високо от честотата на друга семейна форма на кардиомиопатия - разширена (1 на 2500). HCM се наследява

на автозомно доминантния тип и се характеризира с пенетрантност до 75%. Клинично, заболяването се проявява под формата на лява и / или дясна вентрикуларна хипертрофия и увеличаване на атриалния размер. Хипертрофията обикновено е асиметрична и засяга интервентрикуларната преграда. Хистологично се наблюдават хипертрофия и неравномерно подреждане на кардиомиоцитите, както и интерстициална фиброза в мускула на сърцето. Заболяването води до аритмии и внезапна смърт, както и до сърдечна недостатъчност.

Причината за заболяването на молекулярно ниво е дисфункция на протеините, които съставляват саркомера, така че hcmp понякога се нарича саркомерна болест. Хипертрофията е компенсаторна миокардна реакция към намаляване на контрактилитета. В момента са идентифицирани 11 гена, мутации в които водят до hcmp (Таблица 4.11).

Мутациите на саркомерни протеини имат различен ефект върху контрактилната функция на кардиомиоцитите. В резултат на това миссенсните мутации често образуват стабилни, но неактивни протеини, които се вмъкват в саркомера и нарушават неговата функция, т.е. имат доминиращ негативен ефект. За разлика от това, мутациите

Таблица 4.11. Мутации, водещи до хипертрофична кардиомиопатия

с промяна в рамката, те водят до образуването на неактивни съкратени протеини, които са обект на ускорено разграждане. И в двата случая контрактилната активност намалява и се развива компенсаторна хипертрофична реакция.

Типът мутация може да повлияе на тежестта на заболяването. Например, висок риск от внезапна сърдечна смърт е свързан с мутации в MYH7 гена Arg_4oz-Gln, Arg_45z-Cis и arg_72z-Gly. За разлика от Gly мутацията_25б-Glu, Val₆₀₆-Срещнах се и Лей₉₀₈- Валът не е свързан с повишен риск от аритмии. Мутациите в MYBPC3 гена обикновено се свързват с лека хипертрофия при млади пациенти, късно начало на заболяването и относително благоприятна прогноза. По този начин, познаването на типа мутация не само потвърждава диагнозата hcmp, но в някои случаи помага при определяне на прогнозата.

Поради значителната генетична хетерогенност, молекулярната диагностика на hcmp представлява определена сложност. Поради разнообразието от мутации, за търсене на това заболяване се използват главно скрининг методи като анализ на полиморфизъм на конформация на едноверижна ДНК, електрофореза в денатуриращ градиент и също денатурираща HPLC. Търсенето на мутации се извършва главно в β-миозиновия тежковерижен ген, както и в гените на сърдечния тропонин Т и сърдечния миозин-свързващ протеин С.

Биохимична диагностика на чернодробни заболявания. Кратка информация за структурата на черния дроб.

Биохимична диагностика на заболявания

Декодиране на биохимичен анализ на кръвта

Какво показва биохимичен кръвен тест?

Какви са показанията за биохимичен анализ на кръвта?

Как да вземете кръвен тест за биохимия?

Норми за биохимичен анализ на кръвта (таблица)

Как да дешифрираме биохимичния анализ?

Общ протеин

билирубин

ензими

Пикочна киселина

Колко е биохимичен кръвен тест?

Биохимия и патобиохимия на черния дроб. Биохимична диагностика на чернодробно заболяване

Биохимична диагностика на заболявания

ГЛАВА 4 БИОХИМИЧНА ДИАГНОСТИКА НА ПАТОЛОГИЧНИТЕ ПРОЦЕСИ И НАСЛЕДОВАТЕЛНИ БОЛЕСТИ t

Прочетете За Почистване На Черния Дроб

Популярни Категории

Киста На Черния Дроб

Рак На Черния Дроб