Принцип. Преброяване на левкоцитите по време на микроскопията в определен брой квадрати на броената камера и изчисляване на техния брой в 1 литър кръв, като се вземе предвид разреждането на кръвта и обема на броената камера.
Реагент: 3-5% разтвор на оцетна киселина, оцветени за оцветяване на ядра от левкоцити с няколко капки разтвор на метиленово синьо. Разтворът има син цвят, може да се съхранява дълго време.
Курсът на определяне. В суха епруветка се налива 0,4 ml разтвор на оцетна киселина. От пръста се събира 0,02 ml кръв (можете да използвате стабилизирана венозна кръв). Избършете върха на пипетата, след това издуйте кръвта от нея на дъното на епруветката, разбъркайте, наберете отново и издухайте сместа от кръв и реагент (пипетиране). Отбележете епруветката и я оставете до преброяването. Съхранявайте смес от кръв с разтвор на оцетна киселина се препоръчва не повече от 2-4 часа.
Кръвта се разрежда в епруветка с оцетна киселина, разбърква се добре и се напълва с броене. Напълнената камера се оставя в хоризонтално положение в продължение на 1 минута, за да се утаят белите кръвни клетки. Без да се променя хоризонталната позиция на камерата, те я поставят на масата на микроскопа и при ниско увеличение (окуляр 10х, обектив 8х) преброяват белите кръвни клетки в 100 големи квадрата, което съответства на 1600 малки.
За по-голяма точност левкоцитите се преброяват в мрежата на големи квадратчета, които не се разделят на малки квадратчета и ивици, започвайки от горния ляв ъгъл на решетката. За по-добър контраст, затъмнете зрителното поле, пуснете кондензатора и затворете отвора. Клетките, разположени вътре в квадрата и разположени върху две линии, се преброяват, за да не се брои два пъти една и съща клетка.
Изчисляването на броя на левкоцитите се извършва по формулата:
където X е броят на левкоцитите в 1 μl кръв; и - броя на левкоцитите в 100 големи квадрата; 20 - разреждане на кръвта; 100 е броят на големите квадрати; 250 е коефициентът на превръщане за 1 μl, тъй като обемът на един голям квадрат е 1/250 μl (страната на квадрата е 1/5 mm, височината е 1/10 mm).
На практика, за да се изчисли броят на левкоцитите в 1 μl кръв, броят им в 100 големи квадрата се умножава по 50, а в 1 литър - получената стойност се умножава по 106.
Забележка. При преброяване на левкоцитите, грешка е неизбежна в 6-8% от случаите.
- При голям брой нормоцити в периферната кръв те се броят в броя на левкоцитите (левкоцити и нормоцити - ядрени клетки). За да се установи правилно броят на левкоцитите, от общия брой ядрени кръвни клетки трябва да се извади броят на нормоцитите.
- Останалите грешки са сходни с тези, които възникват при изчисляване на броя на червените кръвни клетки в броената камера.
Брой левкоцити
За събиране на кръв в левкоцитния смесител до марката 0.5. Към кръвта незабавно да се прибави разтвор за разреждане от 3% оцетна киселина, за да се отбележи 11. Разбъркайте добре съдържанието на капиляра и го напълнете отново с камерата на Горяев. Преброяването се извършва в поне 100 големи квадрата. Това са големи ненасочени линии, които са групирани в четири в мрежата на камерата на Горяев. Изчислява се броят на левкоцитите в 1 l кръв по формулата:
L = N x 4000 x 20 x 10 6
където: N е броят на левкоцитите в сто големи квадрата; 4000 е множител, който намалява обема на малък квадрат до обем от 1 μl кръв; 20 - корекция за степента на разреждане на кръвта; 1600 - броят на левкоцитите в малки квадратчета; 10 6 - броят на микролитите в 1 l.
Препоръки за регистрация
В заключение, сравнете получените резултати с нормалните стойности.
Лаборатория № 7.3
Определяне на количеството хемоглобин в кръвта
194.48.155.245 © studopedia.ru не е автор на публикуваните материали. Но предоставя възможност за безплатно ползване. Има ли нарушение на авторските права? Пишете ни Свържете се с нас.
Деактивиране на adBlock!
и обновете страницата (F5)
много необходимо
Преброяване на броя на белите кръвни клетки
Левкоцитозата може да бъде абсолютна (истинска) и относителна (редистрибутивна).
Абсолютна левкоцитоза се наблюдава при остри възпалителни процеси, тъканна некроза, остри бактериални инфекции (с изключение на коремен тиф, бруцелоза, туларемия и др.), Алергични състояния, злокачествени тумори (с разрушаване на тъканите), затворени наранявания на главата и кръвоизливи в мозъка, диабет. уремична кома, шок, остра загуба на кръв, като първична реакция - с лъчева болест. С левкемия се наблюдава значително увеличение на броя на левкоцитите.
Относителна (редистрибутивна) е следствие от получаването на левкоцити в кръвния поток от органите, които служат за нейното депо. Това се случва след хранене (хранителна левкоцитоза), топли и студени вани, силни емоции (вегетативно-съдова левкоцитоза), интензивна мускулна работа (миогенна левкоцитоза) и др.
Левкопения. Левкопенията се разглежда като индикатор за инхибиране на функционалната способност на костния мозък в резултат на излагане на токсични вещества (арсен, бензен и др.), Някои медикаменти (сулфаниламиди, хлорамфеникол, бутадион, имуно, циклофосфамид и др.), Вируси (грип, вирусен хепатит)., морбили и т.н.), микроби (тиф, бруцелоза и др.), йонизиращо лъчение, рентгенови лъчи и хиперспленизъм (повишена функция на далака).
Левкоцитозата и левкопенията рядко се характеризират с пропорционално увеличение (намаление) на общия брой левкоцити от всички видове (например левкоцитоза с удебеляване на кръвта); в повечето случаи се наблюдава увеличение (намаляване) на броя на всеки един клетъчен тип, поради което се използват термините "неутрофилия", "неутропения", "лимфоцитоза", "лимфопения", "еозинофилия", "еозинопения", "моноцитоза", "моноцитопения"., "Басофилия".
При клиничната оценка на промените в броя на левкоцитите се отдава голямо значение на процентното съотношение на отделните форми на левкоцити, т.е. левкоцитна формула.
Левкоцитна кръвна картина на здрав човек:
Относителна сума Абсолютна сума
Базофили ……………………….0-1% 0-0.0650 x 10 9 / l
Еозинофили …………………….0.5-5% 0.02-0.30 x 10 9 / l
Неутрофили: - миелоцити... 0% отсъстват
- намушкан... 1-6% 0.040-0.300 х 109 / l
- сегментирани….47-72% 2.0-5.5 x 10 9 / l
Лимфоцити …………………………….19-37% 1.2-3.0 x 10 9 / L
Моноцити ………………………….3-11% 0.09-0.6 х 10 9 / L
Броенето на левкоцити се извършва при оцветени периферни кръвни натривки. За правилното тълкуване на резултатите от изследването на левкоцитната формула се препоръчва да се отчитат в абсолютни количества, но не и в относителни. Най-често срещаните методи за рисуване на мази от Романовски-Гимзе, Папенхайм. При потапяне се преброяват най-малко 200 клетки и след това се получава процентното съотношение на някои видове левкоцити. Анализът на левкограма, като се вземат предвид други кръвни параметри и клиничната картина, е ценен метод за изследване, помага при диагностициране и определяне на прогнозата на заболяването.
Основните причини за неутрофилия.
Остри бактериални инфекции - локализирани и генерализирани.
Възпаление или некроза на тъканта.
Лекарствени ефекти (кортикостероиди).
Основните причини за неутропения.
Инфекции - бактериални (коремен тиф, бруцелоза, туларемия, паратиф) и вирусни (инфекциозен хепатит, морбили, грип, рубеола и др.).
Миелотоксични ефекти и потискане на гранулоцитопоезата (йонизиращо лъчение; химични агенти - бензен, анилин, ДДТ; лекарствени ефекти - цитостатици и имуносупресори; витамин В12-фолиева киселина дефицитна анемия, остра алейкемична левкемия, апластична анемия).
Експозиция на антитела (имунни форми) - свръхчувствителност към лекарства, автоимунни заболявания (SLE, ревматоиден артрит, хронична лимфна левкемия), изоимунни прояви (хемолитична болест на новороденото).
Преразпределение и отлагане в органи - шокови състояния, заболявания със спленомегалия и хиперспленизъм.
Наследствени форми (фамилна доброкачествена хронична неутропения).
Основните причини за еозинофилия.
Паразитни инвазии (трихинелоза).
Хронични кожни лезии - псориазис, пемфигус, екзема.
Тумори (еозинофилни варианти на левкемия).
Други заболявания - фибропластичен ендокардит Lefflera, скарлатина.
В фазата на възстановяване на инфекциите и възпалителните заболявания (благоприятен прогностичен признак).
Причини за възникване на еозинопения (анеозинофилия).
Повишена активност на адренокортикостероиди в организма.
Основните причини за базофилията:
Хронична миелоидна левкемия и еритремия.
Основните причини за моноцитоза.
Субакутни и хронични бактериални инфекции.
Паразитни инфекции - лейшманиоза, малария.
Хемобластоза - моноцитна левкемия, лимфогрануломатоза, лимфоми.
Други състояния са SLE, саркоидоза, ревматоиден артрит, инфекциозна моноцитоза; в периода на възстановяване от инфекции, при напускане на агранулоцитоза, след спленектомия.
Намаляването на броя на моноцитите е важно главно при оценката на лимфоцитно-моноцитното съотношение при белодробна туберкулоза.
Основните причини за лимфоцитоза.
Инфекции - остър вирусен (инфекциозна мононуклеоза, морбили, рубеола, варицела), хронична бактериална (туберкулоза, сифилис, бруцелоза), протозойни (токсоплазмоза).
Хемобластоза (лимфоцитна левкемия, лимфом).
Други заболявания - хипертиреоидизъм, болест на Адисън, витамин В12-фолиева недостатъчност, хипо- и апластична анемия.
Лимфоцитопения се наблюдава при СЛЕ, болестта на Ходжкин, широко разпространена туберкулоза на лимфните възли, в крайния стадий на бъбречна недостатъчност, остра лъчева болест, имунодефицитни състояния, приемане на глюкокортикоиди.
Увеличаването или намаляването на броя на някои видове левкоцити в кръвта може да бъде относително или абсолютно. Ако само процентът на определен вид бели кръвни клетки се промени, тогава се наблюдава относителна неутрофилия, относителна еозинопения и др. Увеличаването или намаляването на абсолютното съдържание на всеки тип левкоцити, т.е. броя на тези клетки на единица обем кръв, се нарича абсолютна неутрофилия, абсолютна еозинопения и др.
Преместването на формулата наляво (увеличаване на броя на младите форми на неутрофили) е признак на възпаление или некротичен процес в организма.
Преместването на левкоцитната формула в дясно е характерно за лъчева болест и витамин-В12-фолиева киселина дефицитна анемия.
Отсъствието или значителното намаляване на броя на всички видове гранулирани левкоцити - гранулоцити (неутрофили, еозинофили, базофили) се определя от термина агранулоцитоза. В зависимост от механизма на възникване се разграничават миелотоксични (ефекти на йонизиращо лъчение, цитостатичен прием) и имунен (хаптен и автоимунен агранулоцитоза).
Брой левкоцити
Методът за броене във фотоапарата. Вземане и разреждане на кръвта, получена по тръбен метод. 0,4 ml от разредителната течност и 0,02 ml капилярна кръв се въвеждат в епруветката (за предпочитане Vidalevskaya). Полученото разреждане на практика се счита за 1:20, като обикновено се използва 3-5% разтвор на оцетна киселина, оцветена с метиленово синьо, като разредител (оцетната лиза на еритроцитите, метиленово синьо оцветява ядрата на левкоцитите). Преди попълване на камерата Goryaeva тръба с разредена кръв се разклаща добре. Камерата се пълни по същия начин, както при отчитането на червените кръвни клетки.
Левкоцитите са много по-малки от еритроцитите (1-2 на голям квадрат), следователно, за точност, броят се прави в 100 големи квадрата (неразпределени). Изчисление: 100 големи квадрата (1600 малки) се преброяват като левкоцити.
Помня, че обемът на малък квадрат е 1/4000 mm3, а кръвта се разрежда 20 пъти, броят на левкоцитите в 1 μl кръв се изчислява: 4000 20 и се разделя на 1600 = a x 1/2. Практически, за да се получи действителното съдържание на левкоцити в 1 μl кръв, достатъчно е да се разделят на половината от броя на получените в изчислението и се добавят 2 нули. Средната грешка на метода е ± 7%.
По-точна (2-3% грешка) и перфектна е броят на левкоцитите, използващи електронни устройства. Преброяването на левкоцитите в броячите на частици се извършва по същия принцип като еритроцитите. Предварителната кръв се разрежда и се смесва с всеки реактив, лизиращ червените кръвни клетки. В автоанализатора „Technicon“ се използва разтвор на оцетна киселина като такова в устройствата „Culter“ и „Celloskop“ - сапонин или сапоглобин, които се добавят разредени (1: 500, 1: 700) в изотоничен разтвор на натриев хлорид (6 капки на 20 ml). разреждане).
Броят на левкоцитите в кръвта се извършва в оцветени периферни кръвни натривки.
По-добре е да преброите най-тънката точка близо до края на размазването, най-малко 200 клетки (с изключение на изразената левкопения) и след това да получите процентното съотношение на някои видове бели кръвни клетки. Преброяването се препоръчва в същия ред: половината от клетките трябва да се преброяват най-отгоре, половината от дъното на инсулта, без да се стига до самия ръб и средата, зигзагообразно (3-4 зрителни полета по инсулт, 3-4 полета под прав ъгъл до средата на удара, след това 3-4 полета към страната, успоредна на ръба, отново под прав ъгъл нагоре и така до едната страна).
Приготвяне на натривки. Внимателно измитото и обезмаслено стъкло (ръбът му) докосва капка кръв на мястото на инжектиране. Намажете шлифовъчното стъкло, поставяйки го под ъгъл от 45 ° към плъзгача пред капката. След като са извадили чашата до тази капка, те чакат, докато кръвта се разпространи по ръба й, след това с бързо движение лесно извършват стъклото напред, без да я отнемат от обекта, преди да изсъхне цялата капка.
Правилно нанесена намазка има жълтеникав цвят (тънък), не достига краищата на стъклото и завършва с следи (мустаци).
Оцветяване на сухи мази, получени след предварителна фиксация. Най-добрата фиксация се постига в абсолютен метиленов алкохол (3-5 минути) или в смес от Никифоров от равни части абсолютен етанол и етер (30 минути).
Основните хематологични бои включват метиленово синьо и неговото производно - лазурно I (метиленово лазурно) и лазурно II (смес от равни части лазурно I и метиленово синьо), с кисел - водоразтворим жълт еозин.
● Живопис на Романовски-Гимзе. Романовски-Giemsa боя (фабрично произведени) има следния състав: Azur II - 3 г, водоразтворим жълт еозин - 0,8 г, метилов алкохол - 250 мл и глицерин - 250 мл. Работният разтвор на боя се приготвя в размер на 1,5-2 капки от готовата боя на 1 ml дестилирана вода. Боята се излива върху намазка с по-висок слой; време на оцветяване - 30-35 минути След този период тампоните се промиват с вода и се сушат на въздух. При този метод ядрото може да бъде добре диференцирано, но неутрофилната грануларност на цитоплазмата е много по-лоша, така че се използва широко за оцветяване на периферна кръвна мазка.
● Комбинирано оцветяване на May-Grunwald-Romanovsky-Giemsa според Папенхайм. Готово багрило, фиксатор Мей-Грунвалд, който е разтвор на еозинметилен синьо в метиленов алкохол, се пипетира върху фиксирана намазка в продължение на 3 минути. След 3 минути към боята, покриваща разтвора, се добавя еднакво количество дестилирана вода и оцветяването продължава още 1 минута. След това боята се измива и намазка се изсушава на въздух. След това изсушената намазка се пребояди с прясно приготвен воден разтвор на Романовска боя за 8-15 минути. Този метод се смята за най-добър, особено за петна от костен мозък.
Увеличаването на броя на левкоцитите в периферната кръв над нормалното ниво се нарича левкоцитоза, намаление се нарича левкопения. Левкоцитоза (левкопения) рядко се характеризира с пропорционално увеличение (намаляване) на броя на всички видове левкоцити, например левкоцитоза с удебеляване на кръвта. В повечето случаи има увеличение на броя (намаление) на всеки един клетъчен тип. Увеличаването или намаляването на броя на отделните видове левкоцити в кръвта може да бъде относително или абсолютно, в зависимост от общия брой на левкоцитите - нормален, повишен или намален. Промяната в броя, съотношението на отделните форми и морфологията на левкоцитите зависи от вида и вирулентността на патогена, естеството, хода и степента на патологичния процес, индивидуалната реакция на организма.
Левкоцити (левкоцити)
Левкоцити. Количествено определяне на левкоцити. Преброяване на левкоцити с помощта на камерата Горяева. Количествено съдържание на левкоцити. Левкоцитоза.
Бели кръвни клетки
Броят на левкоцитите в кръвта зависи както от скоростта на образуването им, така и от тяхната мобилизация от костния мозък, както и от тяхното използване и миграция в тъканите (до лезиите), улавяне от белите дробове и далака. Тези процеси, от своя страна, се влияят от редица физиологични фактори, и следователно броят на левкоцитите в кръвта на здравия човек е подложен на колебания: той се повишава до края на деня, по време на физическо натоварване, емоционален стрес, прием на протеинови храни и резки промени в температурата на околната среда.
Количествено определяне на левкоцити
Левкоцитите се преброяват с помощта на камерата Горяев и се използват автоматични броячи.
Преброяване на левкоцити с помощта на камерата Горяева
С in vitro метод за вземане на кръв за преброяване на левкоцитите:
- 0.4 ml от разтвор на 3-5% оцетна киселина, оцветена с метиленово синьо, се излива в епруветката. Използвайте капилярна пипета, за да изтеглите 20 μl кръв от прясна капка (разреждане 20 пъти), внимателно я издухайте в епруветка с реагент и изплакнете пипетата. Разбъркайте добре;
- чисто и сухо покривно стъкло се втрива в камерата, така че дъговите пръстени да се образуват в точката на контакт;
- кръв, разредена в епруветка, разбъркайте добре. Краят на кръгла стъклена пръчка отнема капка кръв и я довежда до ръба на полираното стъкло на камерата;
- след напълване на камерата, тя се оставя за 1 минута в покой за утаяване на левкоцити;
- Левкоцитите се разглеждат при ниско увеличение (обектив × 8 или × 9, окуляр × 10 или × 15) с потъмнено зрително поле (с понижен кондензатор или стеснена диафрагма);
- за задоволителни резултати левкоцитите се преброяват в 100 големи квадрата.
Знаейки обема на голям квадрат и степента на разреждане на кръвта, намерете броя на левкоцитите в 1 μl и 1 l кръв. Страната на големия квадрат е 1/5 mm, площта е 1/25 mm2, обемът на пространството над този квадрат е 1/250 mm3.
Формула за отчитане на белите кръвни клетки:
където Б е броят на левкоцитите в 100 големи квадрата;
P - степента на разреждане (20).
Брой левкоцити
Норма: 4.0–9.0 × 10 9 / L
Нарича се увеличение на броя на левкоцитите над 9,0 × 10 9 / l
левкоцитоза, намаляване на техния брой под 4.0 × 10 9 / l - левкопения. Въпреки това, дори 3,5 х 109 в 1 л левкоцити за определен брой индивиди могат да бъдат норма. Според литературата такива хора имат повишена имунна резистентност и е по-малко вероятно да се разболеят, което изглежда се дължи на необходимостта от имунен отговор да има резерв от левкоцити в тъканите, където има 50–60 пъти повече, отколкото в кръвния поток. Очевидно при здрави индивиди с нисък брой на белите кръвни клетки в периферната кръв, техните запаси в тъканите съответно се увеличават. Това явление се обяснява с наследствен и фамилен характер или чрез увеличаване на влиянието на парасимпатичната нервна система.
Левкопенията може да бъде функционална и органична.
Функционалната левкопения се свързва с нарушена регулация на кръвообращението и се наблюдава:
- с някои бактериални и вирусни инфекции (коремен тиф, грип, едра шарка, рубеола, болест на Botkin, морбили);
- под действието на лекарства (сулфонамиди, аналгетици, антиконвулсанти, антитиреоидни, цитостатични и други лекарства);
- при мускулна работа, въвеждане на чужди протеини, нервни и температурни ефекти, гладуване, хипотонични състояния;
- фалшива левкоцитопения може да бъде свързана с агрегиране на левкоцити по време на продължително съхранение на кръв при стайна температура (повече от 4 часа).
Органичната левкопения в резултат на аплазия на костния мозък и нейното заместване с мастна тъкан се среща, когато:
- апластична анемия;
- агранулоцитоза;
- левкопенна левкемия;
- някои форми на болестта на Ходжкин;
- йонизиращо лъчение;
- хиперспленизъм (първичен и вторичен);
- болести на колагена.
левкоцитоза
Левкоцитозата е реакцията на хемопоетичната система върху ефектите
екзогенни и ендогенни фактори. Има физиологична и патологична левкоцитоза.
Физиологичната левкоцитоза е:
- храносмилателна - след хранене, особено с високо съдържание на протеин; броят на левкоцитите не надвишава 10,0 - 12,0 × 10 9 / l и след 3-4 часа се връща към нормалното;
- с емоционален стрес (адреналин), тежко физическо натоварване, охлаждане, прекомерно излагане на слънце (слънчево изгаряне), прилагане на редица хормони (катехоламини, глюкокортикостероиди и др.), през втората половина на бременността, по време на менструация и поради неравномерното разпределение на левкоцитите в кръвта мейнстрийм.
Патологичната левкоцитоза се разделя на абсолютна и относителна.
Абсолютна левкоцитоза - увеличаване на броя на левкоцитите в кръвта до няколко стотин хиляди (100.0–600.0 × 10 9 / l и повече).
- Най-често се наблюдава при левкемия: при хронична левкемия - в 98-100% от случаите, при остра левкемия - при 50-60%. Промяната на съотношението на левкоцитните клетки в костния мозък и кръвната пунктация служи като основа за диагностициране на левкемия.
Наблюдава се относителна левкоцитоза:
- остри възпалителни и инфекциозни процеси, с изключение на коремен тиф, грип, едра шарка, рубеола, болест на Боткин, морбили. Най-голяма левкоцитоза (до 70.0–80.0 × 10 9 / l) се наблюдава при сепсис;
- под въздействието на токсични вещества (отрови от насекоми, ендотоксини), йонизиращи лъчения (веднага след облъчване);
- в резултат на действието на кортикостероиди, адреналин, хистамин, ацетилхолин и дигиталисни препарати;
- с тъканна дезинтеграция (некроза), миокарден инфаркт, тромбоза на периферните артерии с развитие на гангрена, изгаряния, ексудативен плеврит, перикардит, уремия, чернодробна кома;
- значителна загуба на кръв при наранявания, вътрешни, гинекологични и други кръвоизливи.
Увеличаването на броя на левкоцитите при инфекциозни заболявания в повечето случаи е придружено от изместване на левкоцитната формула в ляво
Преброяване на броя на левкоцитите и тромбоцитите
Фактори, влияещи върху коректността на изследването на белите кръвни клетки
- дълго съхранение на кръв при стайна температура
Норми на съдържанието на левкоцити в кръвта
Възраст Брой левкоцити
- 1 ден 11.6 - 22.0
- 1 седмица 8.1.- 14.3
- 1 месец 7.6 - 12.4
- Възрастни 4.0 - 9.0
Методи за определяне на броя на левкоцитите в кръвта.
- Преброяване на броя на левкоцитите в камерата за броене
- Броене на левкоцити в хематологични анализатори
Определяне на броя на левкоцитите в броената камера.
- Преброяването на левкоцити под микроскоп се извършва след лизиране на червените кръвни клетки в 100 големи квадрата на броената мрежа и преизчисляване за 1 литър кръв, въз основа на обема на квадратите и разреждането на кръвта. Броят на левкоцитите трябва да се направи в рамките на 2-4 часа след вземането на кръвта.
- Ако в периферната кръв има ядрени еритроцити, те не се лизират и преброяват заедно с левкоцити. В този случай, за да се определи истинският брой левкоцити, броят на клетките в червения ред се изважда от общия брой на броените клетки.
- Например: Общият брой на левкоцитите в изчислението в камерата (или анализатора) -45x109 / l. При изчисляване на левкоцитната формула е установено, че присъстват 50 еритробласти (нормобласти) на 100 левкоцити.
Изчисляваме действителния брой левкоцити в кръвта:
150 клетки - 45 х 109 / l
100 клетки (левкоцити) - X
X = 100 * 45 * 10/1/150 = 30 * 10/1
Така истинският брой левкоцити в кръвта е 30 х 109 / l.
Основните източници на грешки при изчисляването на левкоцитите в камерата:
- Неправилно съотношение на обемите кръв и оцетна киселина, взети в епруветка.
- Неправилно приготвен разтвор на оцетна киселина (при концентрация повече от 5%, някои левкоцити могат да се лизират, което ще доведе до подценяване на резултата).
- Продължителното излагане на пробата при температури над 28 ° С, което може да ускори лизиса на левкоцитите в пробата и да доведе до подценяване на резултата.
- Неправилно пълнене на камерата Горяев. Както при изчисляването на червените кръвни клетки, камерата трябва да се остави за 1 минута, за да се утаят клетките.
- Камерата на Горяев не беше измита достатъчно добре след предишното определение. Оставащите в камерата левкоцити могат да надценяват резултатите от анализа.
Методи за броене на тромбоцитите
- в камерата за броене
Всяка група методи има предимства и недостатъци.
- Преброяването на тромбоцитите в камерата е достатъчно точно, не изисква изчисляване на броя на червените кръвни клетки. От друга страна, този метод е по-труден, тъй като тромбоцитите в естествената форма са представени от малки и слабо контрастирани елементи. Недостатък на метода е броенето на тромбоцитите в следващите часове след вземане на кръв.
- Определянето на броя на тромбоцитите в кръвните намазки е значително по-ниско по отношение на точността на камерата или автоматичните броячи. Грешки в преброяването на кръвните намазки могат да се дължат на лошо качество на намазката и свързаното с това неравномерно разпределение на тромбоцитите, неточно определяне на броя на червените кръвни клетки. Съществен недостатък на метода е необходимостта от едновременно отчитане на тромбоцитите и червените кръвни клетки в кръвта. Предимството на това е способността да се изследват тромбоцитите по всяко време, независимо от времето на вземане на кръв.
- Методът за определяне на тромбоцитите с помощта на хематологичен анализатор ви позволява да определите точно броя на тромбоцитите, техния среден обем и разпределение по обем.
Брой левкоцити
Броят на левкоцитите се изчислява с помощта на автоматичен брояч или в камерата на Горяев. За да се преброят левкоцитите в камерата, се приготвя туркска течност - разтвор на оцетна киселина, оцветен с воден разтвор на метиленово синьо (0,1 ml от 0,1% разтвор на метиленово синьо се добавят към 9 ml 10% оцетна киселина). В епруветка се налива 0,4 ml течен Türk. Придобийте точно 0,02 ml кръв, внимателно прибавете към разреждащата течност. Разреждането на кръвта е 1:20. Разбъркайте добре и оставете за 4 минути. Напълнете камерата Goryaeva, след внимателно разклащане на тръбата с разредена кръв. Камерата се оставя за 1 минута на плоска повърхност за утаяване на левкоцити. След това левкоцитите се преброяват при ниско увеличение на микроскопа (леща 8, окуляр 10 или 15) с потъмнено зрително поле (с понижен кондензатор или стеснена диафрагма). Счита се, че левкоцитите са в 100 неразкрити големи квадрата, което съответства на 1600 малки. Резултатите от преброяването на клетките в големите квадрати обобщават и изчисляват броя им в 1 μl кръв по формулата:
където X е броят на левкоцитите в 1 μl кръв; А - броят на клетките, преброени в 100 големи квадрата, 1600 - броя на малките квадрати; 20 - разреждане на кръвта; 4000 е множител, който води до обем от 1 μl кръв, въз основа на обема на малък квадрат (1/4000 μl).
Преброяване на левкоцитната формула, оцветени петна периферна кръв. Необходимо условие за правилното отчитане на морфологичните особености на кръвните клетки е правилно нанесен и добре оцветен кръв. Кръв се приготвя върху сухи, чисти, добре обезмаслени диапозитиви, отлежали в смес от Никифоров (етилов алкохол 96 ° и диетилов етер 1: 1). Като вземете предметно стъкло за дълги ръбове, докоснете повърхността му до капка кръв (но не и кожа), освободена от пункцията, или нанесете капка кръв с микропипета или капилярка. Стъклен предмет се държи на масата или в лявата ръка за тесни ръбове. С дясната ръка нанесете стъклото с тесен ръб към стъклото с кръв вляво от капката под ъгъл от 45 ° и го бутнете надясно, докато докосне кръвта. Те чакат, докато кръвта се разпространи по целия ръб на стъкленото стъкло, и след това, с бързо, бързо движение, я отведе от дясно на ляво, докато цялата капка е изтощена. Капка кръв трябва да бъде малка и пропорционална, така че цялото намазкване да се постави върху стъклото, без да достига 1-1,5 cm преди ръба му. Добре направената намазка е тънка, има жълтеникав цвят и завършва с "метла". Изсушените с въздух мазки от кръв се поставят в специални съдове за фиксиране или в обикновени стъклени чаши, пълни с фиксираща течност (метилов алкохол, време за фиксиране 3-5 минути; етилов алкохол, 30 минути; смес Никифоров, 20-30 минути). Фиксираните препарати се изсушават на въздух и след това се оцветяват с багрило Романовски-Гимзе. Крайният разтвор на боя Romanovsky-Giemsa (азурезин) се разрежда 1:10 в необходимия обем за оцветяване. Фиксираните петна се наливат с разредена боя, която се излива върху намазката с възможно по-висок слой. Оцветяването продължава в зависимост от температурата на въздуха в помещението от 25 до 45 минути. След приключване на боята, измийте боята с дестилирана вода и поставете ударите вертикално в дървена стойка за сушене. Микроскопията на кръвта се извършва с потапяне при увеличение 100х10. Преброяването на левкоцити се извършва по линия на зиг-заг ("линия на меандър"), преброяват се 100-200 клетки, като се отчита броят на отделните форми на левкоцити: проби и сегментирани неутрофили, еозинофили, базофили, моноцити, лимфоцити. Изчислете процента на всеки тип клетка.
Преброяване на абсолютния брой фагоцити и лимфоцити Абсолютният брой на фагоцитите (неутрофилите и моноцитите) и лимфоцитите на висши гръбначни се изчислява на базата на данни за броя на левкоцитите в периферната кръв и левкоцитната формула.
Тест за фагоцитна функция
Определяне на фагоцитен индекс и фагоцитен номер
Разработени са голям брой техники за оценка на абсорбцията и усвояването на левкоцитите. Всички те се основават на способността на фагоцитите да абсорбират чужди частици, които съставляват тестовата система (специфичен вид микроорганизъм, зимозан, латекс - обект на абсорбция). Откриването се извършва in vitro или in vivo. Общият курс на определяне е следният: Хепаринизирана или цитратна прясна кръв (или фагоцитна суспензия) се смесва с равен обем суспензия от суспензия (Saccharomyces cerevisiae, Staphilococcus aureus, S. albus, E.coli, A. nydrophila) или друг абсорбиращ обект. Сместа се смесва внимателно и се поставя в термостат (37-40ºС - за топлокръвни в зависимост от нормалната температура на тялото, 26 ° C - за топлинолюбиви риби и по-ниски за студенолюбиви). След 15, 30, 45, 60 и 90 минути се получават намазки върху предметни стъкла, сушат се, фиксират се с метилов алкохол или смес от Никифоров и се оцветяват съгласно Romanovsky-Giemsa. Те разглеждат мазнините при потапяне и определят фагоцитната активност - процентът на фагоцитите, участващи в фагоцитоза, фагоцитният индекс - броят на тестовите микроби, уловени от един фагоцитен левкоцит, фагоцитният брой - средният брой фагоцитни обекти на 1 активен неутрофил. Оценката на показателите на различни интервали от време ни позволява да оценим динамиката на фагоцитозата. Обикновено след 90 минути фагоцитният индекс трябва да бъде по-нисък от 45 минути и 60 минути, поради храносмилането на микробите. В случай на нарушение на храносмилането, той не се променя.
Оценка на функционалната активност на фагоцитите чрез редукция на нитро-синия тетразол (NBT-тест)
Този тест е индикатор за бактерицидната функция на фагоцитите и ви позволява да оцените тяхната способност да зависят от кислорода. Когато този механизъм на убиване е активиран, ензимът NADPH оксидаза се активира, което води до появата на реактивни кислородни видове в фагоцитите. Освобождаването на такива вещества в клетката се нарича кислородна (дихателна) експлозия, която може да бъде регистрирана с помощта на NBT теста. При формулирането на този тест се добавя веществото нитрозиний тетразолиум към фагоцитите, той се абсорбира от клетката и в присъствието на реактивни кислородни видове се превръща в тъмно синьо оцветено вещество, диформазан. Колкото по-тъмно сини гранули са фиксирани на повърхността, така и във вътрешността на фагоцитите, толкова по-активни форми на кислород се образуват, колкото е по-силно кислородно-зависимото убиване.
NBT тестът е в две версии: спонтанен и индуциран. При установяване на спонтанен NBT-тест, фагоцитите се култивират в присъствието на NST без предварително активиране на клетките, при провеждане на индуциран NBT-тест, активатор на фагоцитната реакция се добавя към културалната среда. Определянето на NBT теста в два варианта позволява да се изчисли функционалният резерв на клетките, което е разликата между броя (интензивността) на индуцираните диформазан-положителни клетки и броя (интензивността) на спонтанните диформазан-положителни клетки. Стойностите на индуцирания NBT тест характеризират активността на фагоцитните клетки в присъствието на антигенен стимул и се считат за критерий за тяхната готовност за пълна фагоцитоза. Спонтанният NBT-тест позволява да се оцени степента на активиране на кислород-зависимите механизми на убиване на неактивираните фагоцити. Той характеризира степента на активиране на вътреклетъчните микробицидни системи.
За да се образува спонтанен тест за NBT, към 0,1 ml кръв се добавят 0,05 ml 0,2% разтвор на NBT в калиев фосфатен буфер (0,1, рН 7,3) и 0,05 ml от същия буфер. Успоредно с това се взема проба за отчитане на индуцирания NBT тест, при който вместо 0,05 ml буфер се добавя същия обем фагоцитен активатор (например пирогенал при концентрация 50 μg / ml). Реакционната смес се термостатира във водна баня при 37 ° С (30-60 min). Приготвят се мазилки със средна плътност, изсушават се на въздух и се фиксират в етилов алкохол или в смес Никифоров (20 min), след което се боядисват с воден разтвор на неутрално червено (0.1%, 1 min).
След реакцията, кръвните намазки се микроскопират при потапяне (100 × обектив, 10 × окуляр). Сред 100 клетки се изчислява делът на активираните неутрофили (DAN,%), съдържащи гранули на диморфаза. Броят на депонираните в клетките на дифомазан оценка на тяхната активност в произволни единици и изчисляване на индекса на неутрофилно активиране (IAN, използван):
където е Нотр. - броя на клетките, които не съдържат гранули на диморфаза;
Н1 - броя на клетките, в които площта на отлаганията на диформазан е по-малка от 1/3 от площта на ядрото;
Н2 - броя на клетките, в които отлаганията на диформазан отнемат от 1/3 до целия размер на ядрото;
Н3 - броят на клетките, в които депозитите на диформазан заемат по-голяма площ от ядрото.
Получаването на коефициента на мобилизация (КМ) се извършва по следната формула: